Immunohistochimie

[invitebab98739]

BONJOUR:
Je suis une technicien de laboratoire anatomopathologie et svp j'ai besoin des information sur la technique d'immunohistochimie (protocole ,problème de la technique...)
MERCI
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[invitefe0fd50c]

Protocole général d'immunohistochimie (IHC)
I. Matériels requis
Réactifs
- Un (ou plusieurs) anticorps primaire couplé(s) ou non et spécifiques de votre(s) molécule(s) d’intérêt
- Kit de révélation
- Chromogène

Tampons
- Xylène
- Bains d'alcool à 70%, 80% et 95%
- Péroxyde d'hydrogène (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20

Matériel
- Des pipettes et un Pipet-aid
- Bain-marie


II. Durée de l’expérimentation
- 10 mn de blocage des péroxydases
- 30 mn de démasquage antigénique
- 1 h d'incubation de l'anticorps Iaire
- 10 mn de chromogène
- 2 h de bains et de rinçages divers
- TOTAL : 4 heures


III. Mode opératoire
- Déparaffiner la section dans 3 bains de xylène de 5 minutes chacun.
- Laver la section dans des bains d‘alcool benzylique à 96 %, 80 % et 70 % pendant 5 minutes chacun.
- Rincer à l’eau distillée.
- Bloquer les peroxydases endogènes en incubant le tissu dans du peroxyde d’hydrogène (H2O2) 3% pendant 10 min.
- Rincer à l’eau distillée.
- Pour démasquer l’antigène : immerger la lame dans du tampon Tris-EDTA buffer, pH 9.0, 0.05% Tween- 20*, et incuber à 95°C dans un bain-marie pendant 30 minut es. (Sinon adapter à votre protocole interne en gardant le pH requis)
- Sortir la lame à température ambiante et la laisser refroidir dans du tampon Tris-EDTA buffer, pH 9.0 pendant 15 min.
- Rincer à l’eau distillée.
- Laver dans du tampon Tris-Hcl 0,05 M (pH 7,6) avec 0,2 % de Tween-20 (Tampon A) pendant 5 minutes.
- Appliquer sur le tissu l’anticorps primaire dilué dans du tampon Tris-Hcl 0,05 M (pH 7,6) avec 0,05 % de Tween- 20 selon une dilution comprise entre 1/100 et 1/200 pendant 1 heure en chambre humide.
- Laver 2 fois pendant 5 minutes dans le tampon A.
- Appliquer l’anticorps secondaire (le protocole dépend du fournisseur) et appliquer le protocole standard d’immunohistochimie (HRP – Peroxyde – DAB).
- Laver 2 fois pendant 5 minutes dans le tampon A.
- Ajouter le chromogène (DAB), laisser 10 minutes.
- Rincer à l’eau.
- Colorer à l’hématoxyline pendant 5 minutes.
- Laver à l’eau pendant 10 minutes.
- Déshydrater le tissu dans 2 bains d‘alcool benzylique à 96% pendant 5 minutes chacun.
- Laver le tissu dans 2 bains de xylène pendant 2 minutes chacun.
- Monter la lame pour l’observation.

[invite6f9dc52a]

Citez vos sources, ne vous appropriez pas le travail d'autrui: http://www.clinisciences.com/lire/im...himie-957.html

[invite4ab31fa6]

Bonjour,

généralement en Anapath on dispose désormais d'automates pour gérer ce genre de réaction. Seules les réactions d'immuno fluorescence sont encore faite manuellement, et encore...

Après, pour avoir des protocoles précis, il faut voir les fabricants d'anticorps, d'automates et les adapter au désidératas du lecteur ... Mais dans les contexte actuel avec les velléités d'accréditation, je suis convaincu qu''il ne faut pas chercher à jouer les apprenti sorcier et se fier au fabricants qui sont eux certifiés IVD et surtout de proscrire les techniques manuelles (à regret...).

Les soucis les plus fréquents en IHC sont le décollement, lames silanées obligatoire, voir plus (pour mémoire la coupe tiens sur la lame grâce à des interactions de Van der Walls...). Viennent ensuite des problème de masquage des site antigénique non résolu par l'étape de démasquage. Les solutions, maîtriser la fixation (temps notamment...), utiliser des protéases, pour info, la prière n'est pas efficace . Les bruits de fonds viennent ensuite, (avec les anticorps commerciaux on peux espérer l'absence de marquage on spécifique) on peut alors agir sur la concentration en anticorps, le temps d'incubation et les rinçages. Enfin, les signaux peuvent être peu intenses en raison de la faible abondance de la cible. Il existe dans ce cas des kits d'amplification du signal.
Si rien ne fonctionne, comme pour toutes techniques de biologie, on refait toutes les sauces, on nettoie tout et on recommence...le plus souvent cela marche .

Ensuite on peut finasser sur le montage des lamelles en supprimant l’excès de colle pour une meilleurs qualité de lecture.

Voila, si tu as des problème plus précis à soumettre, j’essaierai de te répondre ou je t'enverrai vers l'association ACP francophone qui distille régulièrement des formations sur ce thème ....

Bon week-end!

[A voir en vidéo sur Futura]