optimisation pcr
je fais mon projet de recherche sur la detection des mutations d'un virus ( hépatite B) , j essaie d amplifier un géne de ce virus mais j ai un probléme avec le pcr , je trouve toujours des bandes non spécifiques. est ce qu il ya qqn qui peut m aider a resoudre ce probléme
Bonsoir,
Premierement je scannerais les oligo dans une banque de donnée contenant le genome du virus et des cellules où vous les cultivez. Etes vous certains que vos oligos sont spécifiques?
Ensuite vous pouvez faire varier la T° de la phase d'hybridation. C'est tres important pour la PCR de bien utiliser une bonne température. Faites des essais entre 55°C et 65°C. Vous pourrez sans doute faire disparaitre des bandes aspécifiques.
Si vous amplifiez de longs fragments aspécifiques vous pouvez diminuer la durée de la phase d'elongation. Ils n'auront pas le temps d'être synthétisés efficacement.
Si le fragment que vous cherchez est "long", il peut être interessant de mettre quelques cycles longs (1'; 1'; 1') en debut de PCR pour amplifier rapidement ce fragment puis apres de mettre vos 30 ou 35 cycles.
Voilà deux trois pistes pour vous.
Cordialement,
piwi
