Mise en évidence de l'activation de Raf

[Meiosis]

Bonjour,

Dans un exercice je dois proposer deux techniques expérimentales permettant de montrer l'activation de Raf dans la voie des MAPK.
Voici ce que j'ai fait, j'aimerais savoir si c'est correct ou s'il y a mieux.

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Quand Raf est activé par Ras il devient phosphorylé.

1ère technique Western blot classique : des anticorps anti-Raf phosphorylés.

2ème technique : RIA (radioimmunoassay)
Des anticorps anti-Raf phosphorylés reconnaissent des Raf phosphorylés radiomarqués (ligands chauds).
On extrait ensuite les Raf phosphorylés de l'échantillon biologique d'intérêt (donc non marqués, ligands froids) et on met en contact ces Raf phosphorylés issus de l'échantillon avec les anticorps anti-Raf phosphorylés. Par compétition les Raf phosphorylés "froids" décrochent les Raf phosphorylés "chauds" => plus il y a de Raf phosphorylés dans l'échantillon de départ plus les Raf phosphorylés chauds seront décrochés des anticorps => on mesure la radioactivité dans le surnageant et cela renseigne donc sur le taux de Raf phosphorylés de l'échantillon initial et donc sur le degré d'activation de Raf.

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Voilà.
Le problème c'est que ces deux techniques mettent en évidence la phosphorylation de Raf et j'aimerais savoir s'il n'y avait pas une autre caractéristique à mettre en évidence pour l'activation de Raf (autre que la phosphorylation donc).
Par exemple notre prof nous a donné un exemple avec Erk1 et il a dit qu'on pouvait mettre en évidence la phosphorylation de Erk1 mais aussi sa translocation vers le noyau or Raf ne va pas vers le noyau quand il est activé donc je ne peux pas faire ça.

J'espère que vous pourrez m'aider à y voir plus clair, merci.
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[Meiosis]

Petit UP. (10 caractères)

[Flyingbike]

ce ne serait pas suffisant expérimentalement, mais tu peux regarder l'état d'activation de Raf vial la phosphorylation de ses substrats, vu que c'est une kinase.

si la séquence reconnue par raf est assez consensuelle, on peut aussi imaginer une mesure de l'activation avec une sonde spécifique, mais c'est plus compliqué...

[Meiosis]

Merci pour la réponse.

J'y avais pensé mais je ne voulais pas le faire car l'exercice insiste bien pour choisir une seule cible (ici Raf) donc je ne sais pas si j'ai le droit de regarder d'autres substrats ou si c'est hors sujet. Expérimentalement ça marche mais comme c'est un exo...
À part la phosphorylation de Raf j'avais trouvé quelque chose d'autre mais pas sûr : peut-on faire une analyse interaction protéine-protéine pour montrer l'association de Raf avec une autre protéine et si cette interaction se fait uniquement quand Raf est activé alors ça voudra dire qu'effectivement il est activé ?
Donc est-ce que MEK (un de ses substrats) n'est associé à Raf que quand Raf est phosphorylé ou même quand il ne l'est pas ?

Sinon j'avais 2 petites questions concernant le western blot :

1) est-il utile de montrer que le taux de Raf ne bouge pas et que c'est p-Raf qui augmente pour montrer que la transduction est due à un changement de l'état de phosphorylation de Raf et non à une augmentation de la transcription du gène Raf ?

2) je demande ça car dans une analyse d'article des auteurs faisaient ça. Mais je n'ai pas compris pourquoi le taux de Raf ne bouge pas car si p-Raf augmente forcément ça fait diminuer Raf non phosphorylé à moins que l'anticorps puisse reconnaître une partie commune au Raf phosphorylé et au non phosphorylé ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

Merci pour la réponse.

J'y avais pensé mais je ne voulais pas le faire car l'exercice insiste bien pour choisir une seule cible (ici Raf) donc je ne sais pas si j'ai le droit de regarder d'autres substrats ou si c'est hors sujet. Expérimentalement ça marche mais comme c'est un exo...
À part la phosphorylation de Raf j'avais trouvé quelque chose d'autre mais pas sûr : peut-on faire une analyse interaction protéine-protéine pour montrer l'association de Raf avec une autre protéine et si cette interaction se fait uniquement quand Raf est activé alors ça voudra dire qu'effectivement il est activé ?
Donc est-ce que MEK (un de ses substrats) n'est associé à Raf que quand Raf est phosphorylé ou même quand il ne l'est pas ?

Dans ce cas précis, je ne sais pas, mais c'est complexe... Parce qu'il faut distinguer l'interaction de la phosphorylation, et il est difficile de savoir s'il n'y a pas interaction sans activité kinase, et si il n'y a interaction que lors de la phosphorylation, rien ne garantit que l'immunoprécipitation pourra fonctionner (c'est peut être extrêmement labile)... En tout cas ce n'est pas une méthode pratique...

Sinon j'avais 2 petites questions concernant le western blot :

1) est-il utile de montrer que le taux de Raf ne bouge pas et que c'est p-Raf qui augmente pour montrer que la transduction est due à un changement de l'état de phosphorylation de Raf et non à une augmentation de la transcription du gène Raf ?

2) je demande ça car dans une analyse d'article des auteurs faisaient ça. Mais je n'ai pas compris pourquoi le taux de Raf ne bouge pas car si p-Raf augmente forcément ça fait diminuer Raf non phosphorylé à moins que l'anticorps puisse reconnaître une partie commune au Raf phosphorylé et au non phosphorylé ?

1) Ça dépend des cas, et des écoles.... Certains pensent en "ratio", mais si la forme déphopshorylée est inactive, on s'en fout car ce qui compte dans le message est la quantité ABSOLUE de la forme active. Cependant, une augmentation de l'activité d'une protéine peut être uniquement la conséquence d'une augmentation de sa quantité totale... En fait cela dépend du message et du contexte, mais il est tout de même plus rigoureux de présenter les formes totales, dans tous les cas.

2) en général dans ce type d'étude, on utilise un Ac dit "forme totale" et un Ac "forme phospho". Le premier reconnait la protéine en général (et donc pas uniquement la forme déphosphorylée), le second la forme phosphorylée. Les anticorps qui reconnaissent une absence de modification post-traductionnelle sont plutôt assez rares (pour ma part je n'en ai jamais croisé, je ne sais même pas si ça existe???)

[Meiosis]

Bonjour et merci pour la réponse.

Donc j'ai mieux compris pour les anticorps et le western blot.
Concernant la première technique je vais donc l'abandonner : finalement rester sur du western blot et du RIA est-il correct ? Car je ne trouve pas mieux.
Cela fera redondant en montrant deux fois la phosphorylation, c'est surtout ce qui me gêne en fait.

[Flyingbike]

a part que c'est plutôt complexe comme technique oui, mais tu dois préciser comment tu marques les P-Raf aussi

[Meiosis]

Ok, j'ai vu sur wiki qu'on pouvait utiliser un radioisotope de l'iode (le 125) et l'attacher à des tyrosine de Raf (ça tombe bien il y a des tyrosine j'ai vérifié).
Par contre je ne sais pas comment ça se passe en vrai pour l'attacher à des tyrosine et j'ai pensé au cheminement suivant :

- Faire lyser des cellules dont on sait qu'elles expriment beaucoup de Raf-phosphorylé (pour en avoir assez) et purifier les Raf phosphorylés avec des colonnes avec des anticorps anti-Raf phospho (celui dont on parlait hier) => inconvénient ça coûte cher et il y a peut-être mieux pour avoir des Raf phosphorylés en grande quantité.
- Marquer les Raf phosphorylés récupérés, donc avec le 125 iode en l'attachant aux tyrosine de Raf => je ne sais pas comment on attache ça en vrai.
- Technique RIA à proprement dit : ça se passe en bécher ou autre (aucune idée) ?
- Lecture de la radioactivité des p-Raf marqués : compteur gamma, j'ai peut-être mal traduit ce que j'ai vu sur le wiki anglais mais c'est marqué qu'ils détectent la radioactivité avec un "gamma counter" jamais entendu personnellement.

[Flyingbike]

Pour ton histoire d'iode 125, c'est plutôt utilisé en chimie des protéines, pas dans ce genre d'étude. On marque des protéines déjà purifiées, donc il faudrait purifier du Raf, le marquer, faire la compétition ...! Pour info la iodination se fait par substitution electrophile sur le phénol de la tyrosine je crois.

Le RIA se fait généralement en petits tubes de 4mL

La lecture de radioactivité se fait avec un compteur, selon le type d'émission, c'est un appareil qui compte en "CPM", donc qui donne une activité de désintégration, proportionnelle a la quantité de radio isotope. C'est une machine ou tu peux avoir un passeur de tubes, tu mets ta série, et la machine te compte tes émissions pendant un certain temps (secondes, minutes, etc) dans chacun des tubes...


en fait c'est vachement complexe ton idée. Si tu veux marquer la phosphorylation de Raf il y'a bien plus simple : incuber tes cellules avec du gamma 32P ATP, comme ça les protéines phosphorylées seront chaudes, tu purifies Raf avec un anticorps et tu comptes le signal dans ton isolat. Mais ça n'a aucun intérêt par rapport au Western.

La ou ça peut être intéressant, et c'est d'ailleurs pour cela que cette technique est utilisée : c'est mesurer a proprement dit l'activité kinase, donc on pourrait imaginer un protocole de mesure de l'activité de Raf, et non plus de sa phosphorylation (ce qui ne garantit d'ailleurs pas son activité)...

[Meiosis]

Bon finalement je vais laisser le RIA alors si c'est trop complexe pour rien.

Par contre je t'ai suivi jusque là :

La ou ça peut être intéressant, et c'est d'ailleurs pour cela que cette technique est utilisée : c'est mesurer a proprement dit l'activité kinase, donc on pourrait imaginer un protocole de mesure de l'activité de Raf, et non plus de sa phosphorylation (ce qui ne garantit d'ailleurs pas son activité)...

Je ne vois pas pourquoi "compter" le taux de p-Raf avec la technique de l'ATP marqué peut permettre de mesurer l'activité kinase de Raf ?
Et je ne vois pas pourquoi tu dis que la phosphorylation de Raf ne garantit pas son activité ? Depuis le début je pensais que Raf phosphorylé = signifie qu'il est activé, ce n'est pas le cas ? Car c'est le sujet de l'exercice et si je me trompe...

Par ailleurs la technique de l'ATP marqué que tu proposes porte-t-elle un nom spécifique ?

Mais j'avais pensé à RIA car d'après moi le western blot est plutôt qualitatif (présence de p-raf ou non) même s'il peut être un peu quantitatif alors que le RIA est plutôt quantitatif grâce à une courbe étalon, on pourrait avoir la concentration précise de p-raf dans telles conditions de culture par exemple.

Merci.

[Flyingbike]

j'ai mélangé ma réponse : ce que je te dis permet de mesurer, radioactivement, la quantité de phosphate attachée a Raf. Comme un WB en quelque sorte.

Ce dont je parle par la suite, c'est une autre manip, indépendante, qui utilise les memes outils : le 32P. J'attendais ton retour pour développer. Mais avant, quand je parle de phosphorylation ≠ activation, c'est une remarque générale, une précaution à prendre, parce que pour qu'une protéine soit active, il faut que beaucoup de conditions soient réunies (d'autres modifications post-traductionnelles, des interactions, des substrats, etc...) et donc de façon GENERALE, le fait qu'une protéine soit phosphorée ne veut pas dire qu'elle est capable, a son tour, de phosphoryler ses substrats (d'autant qu'il y a des phosphorylations inhibitrices....)

La technique dont je te parlais est assez simple en théorie : tu purifies par immuno la kinase qui t'intéresse, tu la mets en présence d'un substrat (purifiable) qu'elle est capable de phosphoryler, tu l'incubes avec de l'ATP marqué. Ainsi, la kinase va brancher le 32P sur le substrat, tu pourras le mesurer et en déduire la quantité et donc l'activité REELLE de ta kinase.

Maintenant, on fait des variantes basées sur la luciférase, mais je suis moins familier : le principe est le même, sauf qu'on utilise de l'ATP froid. Une fois utilisé par la kinase, il reste de l'ADP. On mesure ensuite la quantité d'ATP restante par la réaction luciférine + ATP --> ADP + photon + luciférine oxydée , en présence de luciférase, en mesurant l'émission de photons. Ainsi, moins il reste d'ATP, plus l'activité kinase est élevée.


Cette technique s'appelle classiquement kinase assay

[Meiosis]

Merci pour les précisions !

J'ai quelques questions.

- Ici l'activité Raf est proportionnelle à sa phosphorylation dans ce cas précis donc ?

- Admettons que l'activité Raf soit faible donc peu de 32P branché sur MEK. On devrait donc avoir moins de radioactivité à mesurer. Cependant j'ai pensé que comme l'ATP marqué est toujours dans le milieu, ça ne va pas fausser les résultats en donnant toujours le même taux de radioactivité ? Je pense qu'il faudrait enlever l'ATP marqué pour ne mesurer que la radioactivité due à l'incorporation du 32P sur MEK et donc pour que la mesure de la radioactivité ne reflète que la présence du 32P sur MEK et donc l'activité de Raf.

- Pour cette technique je suppose qu'il faut une droite/courbe étalon ?

- Comment mesurer la radioactivité du 32P, pareil que tout à l'heure avec le compteur ?

[Flyingbike]

oui cette voie est plus simple, phosphorylé c'est actif

tu as tout compris, il faut se débarrasser du 32P, c'est pour ça qu'il faut un substrat purifiable. Pour info, dans ce genre d'expérience, on peut avoir un facteur 1000 et meme 10000 entre le signal propre, et le signal du traceur que l'on utilise.

une courbe etalon, oui c'est pas indispensable, tu ne veux pas forcément une valeur absolue (comme dans un WB), l'important c'est d'avoir un point de blanc pour enlever le bruit de fond (dans ce cas, ce serait un tube sans kinase, dont la valeur serait a soustraire des autres). tu n'as pas forcément besoin d'une valeur du style x nmol/mg (de phosphate par mg de protéine)..

oui ça se compte, avec un compteur ß

[Meiosis]

Bonjour et merci pour tes réponses.
J'ai quelques questions et je pense que ce sera les dernières, afin de vraiment cerner le sujet. ^^

1) Si je résume : initialement je lyse des cellules pour récupérer du p-Raf que je purifie avec une colonne avec des anticorps anti-p-raf.
Je fais pareil pour récupérer des MEK non phosphorylés, par contre comment les avoir non-phosphorylés ? En mettant des phosphatases in-vitro par la suite ?

2) Quand j'ai les deux je mets les deux en contact dans des tubes avec de l'ATP marqué avec du 32P mais comment incorporer le 32P à de l'ATP "froid" ?

3) Combien de temps attendre pour l'expérience (le temps que tout le p-raf disponible phosphoryle les MEK) ?

4) J'ai pensé qu'il était nécessaire de mettre un excès de MEK par rapport au p-raf de façon à mesurer l'activité de p-raf même quand elle devient très importante car sinon on aurait un plateau si au bout d'un moment p-raf > MEK. Est-ce correct ?

5) Quand tu parles de "substrat purifiable" c'est une sorte de deuxième purification dans la colonne pour séparer le 32P-MEK du reste (le séparer de l'ATP marqué et du p-raf) ?

6) Je ne vois pas comment on peut avoir une valeur absolue dans le WB (une valeur de concentration quoi) puisque d'après moi le WB c'est qualitatif (présence ou non de p-Raf) et on se base que sur l'intensité des tâches donc c'est pas forcément précis d'après moi.

7) Je ne comprends pas l'utilité du point blanc car s'il n'y a pas de kinase forcément il n'y a aucun 32P greffé sur le MEK donc normalement 0 cpm (pas de bruit de fond) non ?

8) Concernant la valeur que je vais obtenir avec la technique de kinase assay : si on travaille avec le 32P ce sera des cpm et si j'utilise la luciférase des unités arbitraires de luminescence ?

9) Du coup je ne vois pas bien le lien entre l'activité enzymatique de p-Raf (qu'on veut caractériser) et ces unités car une unité enzymatique c'est pas des cpm ni des unités arbitraires.

Merci à toi.

[Flyingbike]

1) idéalement tu purifies un pool de Raf, phosphorylés et non phosphorylés, sinon en ne récupérant que les phosphorylés tu aurais la même activité partout ! (pas passionnant si tu veux mesurer l'activité en fonction de divers paramètres...)

2) l'ATP 32P est commercial, c'est plus simple comme ça, parce que ça n'est pas trop stable longtemps (demi vie de 7 jours)

3) c'est quelques minutes, je ne sais pas, il faut faire une mise au point dans tous les cas

4) oui, un excès de substrat (et d'ATP), par contre tu n'es pas obligé d'utiliser du MEK, tu peux prendre un substrat synthétique, c'est ce qui se fait pour les dosages modernes à la luciférase

5) exactement, tu peux même utiliser un substrat avec un tag pour le purifier avec des billes, encore plus simple !

6) c'est ce que je disais, un WB ne te donne pas de valeur absolue

7) avec un radiotraceur, il n'y a pas de zéro. Parce que déjà il y a un signal naturel, et parce qu'ensuite tu peux avoir des contaminations, des réactions non souhaitées, etc. Par exemple ton traceur qui a une affinité pour un composant de ton mix, certains sont réactifs et donnent un signal important même dans le contrôle (exemple le pyruvate 14C qui se décarboxyle spontanément, donc tu dois le soustraire quant tu veux faire une mesure de son métabolisme !) et il ne faut pas le négliger et toujours faire un contrôle, c'est un réflexe à avoir.

8) exactement, mais en comptant l'activité de ton traceur, tu peux avoir une mesure en nmol de P incorporé par X mg de protéines, par unité de temps, par exemple

9) meme si tu n'as pas un résultat exprimé comme on exprime d'habitude une activité enzymatique, cela reste une mesure quantitative de la capacité de ta kinase a faire son boulot, donc je ne vois pas en quoi ça poserait problème


pratique ton idée de numéroter les questions, ça évite de jouer avec les quote !

[Meiosis]

Bonjour et merci vraiment pour ton aide, c'est intéressant finalement comme exercice de penser à toutes les étapes expérimentales, enfin je trouve que ça change. ^^

Je voudrais juste revenir sur les questions 1, 4 et 8.

1) Je pense m'être mal exprimé. En ne récupérant que les phosphorylés je ne pense pas avoir toujours la même activité puisque certes je n'aurai que des phosphorylés mais selon les conditions de culture j'aurai des taux de p-Raf différents donc si dans une condition de culture n°1 il y a plus de phosphorylés que dans une autre (mais que des phosphorylés dans les deux conditions) j'aurai une activité plus importante dans la condition 1, non ?
Je ne vois pas l'utilité de récupérer les non-phosphorylés en fait vu qu'ils ne seront jamais actifs et que seul le taux de phosphorylés importe donc.

L'inverse pour les MEK, il faut récupérer que ce qui peut être phosphorylable c'est-à-dire des MEK non phosphorylés et du coup je les obtiens bien avec des phosphatases comme j'avais dit ?

4) Je ne vois pas bien ce qu'est un substrat synthétique. Tu dis que je ne suis pas obligé d'utiliser du MEK mais je suis obligé d'utiliser un substrat de p-raf au moins ? Car si je peux utiliser n'importe quel substrat je ne vois pas comment p-raf pourra phosphoryler une molécule qui n'est pas son substrat.

8) L'unité enzymatique de p-raf sera donc exprimée en nmol de phosphate inorganique incorporé par X mg de protéines (protéines substrat ou protéines p-raf ?) et par unité de temps ? Je ne suis pas sûr car il me semble qu'en enzymologie c'est une unité d'activité spécifique et non enzymatique qui est simplement du xmol par unité de temps.

[Flyingbike]

1) non j'ai bien compris; mais vi qu'en général on n'immunoprécipite pas en excès d'anticorps, tu vas te retrouver avec la meme quantité de p-Raf partout. Ce que tu veux c'est un "échantillon" des p-Raf pour mesurer leur activité
Pour les MEK, si tu prends des peptides synthétiques ce n'est pas la peine

4) Ben imagine que la séquence reconnue par Raf fait genre 6 résidus de long, tu fais synthétiser ce peptide, tu rajoutes un tag pour la purification ensuite, c'est plus simple que de purifier du MEK. Mais bien évidemment, il faut un truc reconnu par Raf !

8) Je ne suis pas sur que ce soit nécessaire de ramener a la quantité de Raf, d'ailleurs ça n'a pas trop d'importance. Comme je te le disais, ce qui importe c'est une mesure relative entre deux conditions, car la caractérisation de l'activité enzymatique de Raf (au sens michaelien du terme) n'a aucun intérêt. Tu peux normaliser par rapport a la quantité de protéines purifiées au début, (donc essentiellement du Raf).

[Meiosis]

D'accord merci.

Par contre je viens de penser à quelque chose d'autre :

1) Mes différentes conditions nous sommes bien d'accord qu'ici ce sont différentes concentrations de facteurs de croissance pour lancer la voie des MAPK (et donc l'activation de raf) + une condition sans facteur de croissance (contrôle négatif) ?

2) Faut-il synchroniser toutes les cellules étudiées en GO ? Car je viens de revoir mon cours et j'ai failli oublier ce détail. En effet pour être rigoureux il faudrait faire les expériences sur des cellules en G0 sinon la voie des MAPK est déjà lancée en G1 et p-raf déjà activé.

3) Dans mon cours j'ai noté que pour synchroniser toutes les cellules en G0 il fallait, je cite "enlever le sérum", par contre je n'ai pas eu plus de détails, saurais-tu m'expliquer stp ?

Encore merci.

[Flyingbike]

1) ça dépend de ce a quoi tu t'intéresses, mais oui quand je parle de conditions c'est ce genre de manip (ou insuline, ou invalider un gène dont l'activité pourrait moduler la voie, etc...)

2) ça dépend du contexte, encore une fois. Par exemple tu peux vouloir étudier l'activité Raf sur des cellules quiescentes en réponse a l'IGF, a l'insuline, ou n'importe quoi d'autre. Apres si c'est un effet sur le cycle cellulaire qui t'intéresse il est bien plus propre de travailler sur des cellules synchronisées, mais pourquoi en G0 ?

3) c'est plutôt con comme concept : une cellule en culture ne pousse pas spontanément avec simplement du milieu de culture (= sels, oligo éléments, nutriments), il lui faut du sérum (de veau, d'une autre bestiole, ou un substitut synthétique) qui contient des facteurs de croissance (par exemple tous les trucs en "*GF"). Si tu les retires, les cellules sortent de cycle (cellules quiescentes), jusqu'a ce que tu le remettes, et là elles repartent toutes en même temps (synchronisées)

[Meiosis]

2) En fait je pensais que dans une phase autre que G0 il y aurait déjà la voie des MAPK lancée donc déjà du p-raf qui fausserait les résultats.
Mais je viens de réfléchir à mon erreur : il suffirait d'enlever le sérum pour les mettres toutes en G0 et ensuite remettre les facteurs de croissance à toutes les cellules en même temps et là toutes les cellules commenceront le cycle cellulaire en même temps donc si on les étudie en même temps et dans une phase autre que G0 (par exemple S) on aura quand même des résultats comparables. C'est ça ?

Sinon ici il ne nous a pas été donné de contexte particulier, juste "2 techniques expérimentales permettant de mettre en évidence l'activation de raf" du coup je peux mettre de l'EGF par exemple ou n'importe quel autre facteur de croissance, du moment que ça active raf en fait.

3) Donc j'ai mal pris le cours et j'ai oublié de préciser qu'il fallait remettre le sérum ensuite pour toutes les faire repartir du même point du cycle cellulaire : càd G0. Donc en résumé la bonne version serait d'enlever le sérum pour les mettre toutes en G0 (cellules quiescentes comme tu dis) et ensuite remettre le sérum à toutes les cellules en même temps pour les mettre toutes en conditions d'activer p-raf et donc aller en G1 etc.
Si j'ai bien compris c'est ça ?

[Flyingbike]

2) ça dépendra des tissus/cellules, mais la voie des MAPK ne fait pas QUE de la prolifération, et comme je l'ai dit plus haut elle peut être très fortement activée dans des cellules totalement quiescentes. Tu as bien compris la synchronisation des cellules, mais bon, on pourrait très bien vouloir mesurer l'activation de la voie sur une population homogène !

3) exactement

[Meiosis]

Bonjour,

1) Mais dans ce cas ça signifie qu'en G0 des cellules peuvent activer la voie des MAPK sans facteur de croissance ? Car si une cellule est en G0 c'est qu'elle n'a pas eu de facteur de croissance, enfin c'est ce que j'ai compris.

2) Dans ce cas pour être sûr que le p-raf visualisé est bien celui dû à l'ajout des facteurs de croissance dans les différentes conditions et non au p-raf déjà présent dans les cellules si j'ai bien compris il faut se servir du contrôle négatif (condition sans facteur de croissance ajouté) et retrancher ça aux conditions où on ajoute les facteurs de croissance ensuite ?

3) Pour rebondir sur ce que tu avais dit, on n'est donc pas obligés d'étudier le taux de p-raf sur des cellules en G0/G1 mais en S ou G2 ça reste possible ?
En fait l'important c'est d'étudier le taux de p-raf sur des cellules qui sont toutes dans la même phase du cycle cellulaire donc pas obligatoirement en G0 ?

4) Pour les 2 techniques expérimentales je compte utiliser des cellules HEK rénales, c'est correct ?

[Flyingbike]

1) En bio on aime mettre les voies, les protéines, dans des cases. Mais c'est en général bien plus compliqué que ça (et ça ne s'arrange pas). Regarde la section MAPK ici, et tu comprendras : http://www.cellsignal.com/common/con...ience-pathways

2) si tu veux voir l'effet de ton traitement, c'es t exactement ce qu'il faut faire

3) oui, comme je te l'ai dit c'est un méga carrefour de signalisation, moi par exemple j'ai fait des manips (bon ok c'était sur Erk, un peu plus loin) sur des cellules quiescentes primaires, des lignées non synchronisées, des tissus, en réponse a l'alimentation, a l'insuline, a la surexpression d'un facteur de transcription....

4) tu peux utiliser ce que tu veux, l'important en biologie expérimentale, c'est de bien choisir son modèle en fonction de ce qu'on cherche, et surtout de bien le connaitre (ses limites surtout...)

[Meiosis]

Je vois, en fait c'est vraiment plus compliqué que la théorie mais j'ai compris beaucoup de choses, c'était intéressant.

Je vais rédiger tout ça et si je rencontre un problème je reviendrai, merci à toi pour tes réponses.

[Meiosis]

Bon finalement j'ai terminé j'ai juste un doute.
Pour le western blot j'ai rajouté le système biotine-avidine pour amplifier le signal avec la peroxydase (sur l'anticorps secondaire), est-ce que ça se fait ?

Merci.

[Meiosis]

Et aussi autre question (je viens d'y penser) : tu disais que la purification des p-raf ne se fait pas avec un excès d'anticorps, d'où le fait qu'on ne doit pas purifier que des p-raf mais aussi des raf pour avoir un échantillon représentatif des p-raf pour chaque condition.

Mais pour le western blot si on veut montrer que le taux de raf reste constant (et que c'est le taux de p-raf qui augmente) comme je le disais l'autre jour, faut-il purifier cette fois-ci avec un excès d'anticorps ? Car sinon on aura toujours le même nombre de p-raf/raf (lorsque p-raf/raf >> anticorps) et on croira que le taux de raf reste constant alors que peut-être il augmente mais on ne peut pas le voir car pas assez d'anticorps pour purifier tous les raf.

Merci et désolé du triple post mais la question m'est venue après et je ne peux plus éditer le message précédent.

[Flyingbike]

Bon finalement j'ai terminé j'ai juste un doute.
Pour le western blot j'ai rajouté le système biotine-avidine pour amplifier le signal avec la peroxydase (sur l'anticorps secondaire), est-ce que ça se fait ?

Merci.

Non, cela ne se fait quasiment plus pour les WB avec l'amélioration de la sensibilité des secondaires, des réactifs luminescents et des dispositifs d'imagerie. Surtout avec des anticorps pas exotiques comme ceux la. On utilise simplement un secondaire couplé HRP, voire même et de plus en plus un anticorps primaire couplé.

Mais pour le western blot si on veut montrer que le taux de raf reste constant (et que c'est le taux de p-raf qui augmente) comme je le disais l'autre jour, faut-il purifier cette fois-ci avec un excès d'anticorps ? Car sinon on aura toujours le même nombre de p-raf/raf (lorsque p-raf/raf >> anticorps) et on croira que le taux de raf reste constant alors que peut-être il augmente mais on ne peut pas le voir car pas assez d'anticorps pour purifier tous les raf.

Pas sur de saisir, à cette heure, mais en WB tu n'as rien à purifier, et un anticorps qui reconnait Raf reconnait aussi p-Raf, du coup tu as une image représentative de la quantité globale de protéine, indépendamment de sa phosphorylation. en WB tu as toujours largement assez d'anticorps pour que l'intensité de ton signal soit proportionnelle a la quantité de protéine.

[Meiosis]

Pour la seconde question c'était pour montrer que la transduction est due à un changement de phosphorylation de raf en p-raf et non à une augmentation de la transcription du gène raf, donc taux de raf toujours constant, seul p-raf augmente (comme on avait dit en 1ère page).

Et donc lors de la purification des raf ça se fait pas en excès d'anticorps, du coup on aura toujours le même taux de raf car raf >> anticorps.
Et donc en western blot même si on a un excès d'anticorps cette fois-ci on va toujours détecter le même taux de raf mais on ne pourra pas dire que la transcription du gène est constante car ce taux constant sera seulement dû au fait que les anticorps n'étaient pas en excès lors de la purif. Donc c'est pour ça que je demande s'il faut faire la purif avec un excès d'anticorps pour montrer que le taux de raf reste constant.

Je ne sais pas si je m'exprime bien mais c'est difficile à expliquer.

[Flyingbike]

Tu parles de faire le WB sur les extraits qui servent a la mesure d'activité ? Dans ce cas oui c'est pas idéal quantitativement

[Meiosis]

Non je parle du WB pour détecter les p-raf tout simplement.
En utilisant l'anticorps anti-p-raf le signal va augmenter (dans les conditions avec plus de facteurs de croissance) et en utilisant l'anticorps qui reconnait les deux formes le signal devra rester pareil.
C'est dans l'interprétation qu'on en fait que ça pose problème : ce signal peut rester pareil soit parce que le taux de raf est effectivement inchangé (juste p-raf augmente) soit parce que le taux de raf augmente mais cela n'a pas été visible car on a toujours récupéré le même taux de raf durant la purif (car pas assez d'anticorps).
Donc pour avoir la bonne interprétation je me demande juste s'il faut faire la purif avec un excès d'anticorps, avant de mettre ça sur le gel/membrane et immunomarquer.