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Estimation concentration gel agarose



  1. #1
    lnkjv

    Estimation concentration gel agarose

    Bonjour à tous, je vous contacte car lors d’un TP j’ai réalisé une electrophorese sur gel d’agarose pour estimer la concentration d’un ADN mais je n’ai pas bien compris comment estimer cette concentration.
    J’ai déposé dans le premier puits 2µL de gene ruler DNA mix , dans le 2eme puits 4µL et dans le 3eme 6µL. j’ai ensuite déposé dans un puits 6µL de mon ADN et dans un autre puits 12µL de mon ADN.
    Le prof a estimé la concentration à 4ng/µL mais comment a t’il fait ?
    Il nous a dit qu’il fallait comparer l’intensité de la bande avec la bande de même taille mais après je ne comprends pas comment il arrive à sortir une estimation …
    D’avance merci pour vos explications…

    -----


  2. #2
    Loupsio

    Re : Estimation concentration gel agarose

    Pour connaitre la concentration il faut utiliser un spectrophotomètre micro-volume (type Nanodrop), c'est la seule façon de réellement connaitre la quantité d'ADN présent
    Cependant, avec l'expérience tu peux deviner approximativement en regardant l'épaisseur de la bande (a force d'en avoir vu par centaines),
    sans expérience il est aussi possible d'approximer en faisant une pseudo gamme a partir de concentrations d'ADN connues et comparer les tailles des bandes de quantité connus avec la taille de ta bande de quantité inconnue, mais c'est vraiment pas précis et pas pratique, en gros je pense que c'est la raison pour laquelle tu as mis plusieurs quantité de geneRuler, tu regarde a quelle taille ta bande inconnue correspond par rapport au geneRuler et ensuite sachant que sur le tube du geneRuler ou sur la notice tu dois pouvoir trouver la quantité (soit la quantité par microlitres, soit la quantité totale et a ce moment tu divise par le volume du tube) puisque tu as la quantité d'ADN dans le tube de Ruler (quantité par microlitre) et que tu sais le volume que tu as déposé (2, 4 ou 6 microlitres), tu connais la quantité d'ADN pour chaque epaisseur de bande de Ruler que tu as déposé et ensuite tu en déduis la quantité de ta bande inconnu par rapport a la taille de la bande de chaque ruler dont tu connais maintenant la quantité déposée en nanogramme et la taille de ta bande de concentration inconnue,

    mais c'est vraiment peu précis et loin d'être fiable, rien ne vaut un dosage au Nanodrop.

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