Problème de gel d'agarose

[inviteb9855438]

Bonjour, désolé si la question peut sembler simpliste mais n'ayant pas trouvé de solution a mon problème j'espère que vous vous en trouverez

Voila je fait des gels d'agarose et même si les résultats sont interprétables ils ne sont pas vraiment très propres.
Mais là j'ai une migration qui ne ressemble vraiment a rien ... j'aimerai donc des conseils sur comment mieux réaliser mes gels (surement un problème au moment de le couler selon ma maitre de stage) merci d'avance.

Alors coté Manip :

- mes gels sont des gels 1% d'agarose dans 100mL de TAE (ouTBE sa depend du stock ^^) 1x avec Sybr Safe.
- Le tampon de migration est du TAE (ou TBE en fonction du gel évidemment) 1x.

Des images de mes photos :

Photo normal :

Elle est pas moche moche mais les bandes ne sont pas complètement plates elles sont incurvées.

Migration ratée :

La moche avec des trainé sur les extrémité et on dirai plusieurs front de migration identique.

Voila je suis preneur de TOUS les conseil que vous avez. Merci d'avance.
-----

[invite563835f6]

tes puits sont ils bien propres et bien remplis de tampon au départ ?
quel est ton tampon de dépôt d'ADN ? Quelle quantité ?

[inviteb9855438]

Bien propres oui, remplit par le tampon (pas de bulles)

Pour le depot du DNA loading buffer 10x de S prime (j'ai changé de lot durant mes manip sans changement apperent des résultats), j'en met 1/9 de mon échantillon pour optenir la dilution du tampon de charge au 1x.

[invite563835f6]

mauvaise qualité du tampon (trop vieux..) ?
quel genre d'ADN essaies tu de faire migrer ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb9855438]

pour le tampon de charge je ne pense pas pour le tampon de migration je le change régulierement (environ toutes les 2/3 migrations).

L'ADN est soit un resultat de PCR a partir de plasmides soit une restriction de plasmide. Dans les deux cas il y a une purification sur colonne d'effectué, avant le dépot

[Jean-Luc P]

Est-ce que par hasard tes puits ne sont pas percés au fond, même légèrement ça peut provoquer des trainées.

cxela peut arriver si les supports ne sont pas bien nettoyés ou si le peigne est incurvé.

[invite563835f6]

Sur la 2e photo j'ai l'impression que les puits ne sont pas très rectangulaires.. As tu pris soin de retirer le peigne de manière parfaitement verticale ?

[inviteb9855438]

Les puits sont un peu particulier sur la seconde photo en effet ils sont joint (en fait c'était pour séparer l'ADN par gel afin de le purifier selectivement).
Mais sinon je pense faire attention lors du retrait du peigne; je ferai encore plus attention à bien le faire verticalement desormais pour être sur.

Se qui me gène vraiment c'est la courbure des bandes et les trainées qu'elles laissent dans leur passage .

[inviteb9855438]

Les puits sont un peu particulier sur la seconde photo en effet ils sont joint (en fait c'était pour séparer l'ADN par gel afin de le purifier selectivement).
Mais sinon je pense faire attention lors du retrait du peigne; je ferai encore plus attention à bien le faire verticalement desormais pour être sur.

Se qui me gène vraiment c'est la courbure des bandes et les trainées qu'elles laissent dans leur passage .

[invite4ff72fd5]

Je pense que ça n'a rien à voir avec le peigne.

Le 1er gel est tout à fait normal, tes ladders sont propres, pour les bandes "incurvées" c'est pas super flagrant et surement lié à la quantité d'ADN.

Maintenant le 2eme gel,

tu dis que tu purif sur colonne avant de déposer. Tu le fais systématiquement? Car ca ressemble à une migration d'ADN dans un tampon un peu spécial qui modifie la migration. Quand je dis tampon spécial c'est le conditionnement de ton ADN par rapport à de l'eau. Quand tu modifies ton adn avec des enzymes les tampons d'activité contiennent souvent des produits qui pourrissent la migration, c'est surement ça.

[inviteb9855438]

Je viens d'aller voir mes puits de se matin et effectivement l'un d'entre eux etait percé au fond ! pourtant je n'ai rien noté d'étrange lors du dépot. Par contre ceux qui n'étaient pas percé possèdent eux aussi les trainées et la courbure (pas de smir je pense que le smir c'est dut aux puits percés du coup)

Non effectivement apres une restriction enzymatique je ne repurifie pas c'est vrai et le second gel proviens d'une restriction.

[invitec9f0f895]

salut

Je suis d'accord avec Mantos, soit tu as une concentration en sels trop importante, soit c'est que tu as dans ton tampon d'élution de ta colone des traces plus ou moins importantes de ta solution de lavage de la colone. Ca se produit notamment quand apres les lavages tu ne prends pas soint d'éliminer toute trace de liquide entre le tube collecteur et la colone.

YOyo

[Jean-Luc P]

Au fait en passant ça s'écrit "smear". Désolé pour la remarque sans doute déplacée.

[inviteb9855438]

T'en fais pas elle est pas mal prise du tout
Je suis ici pour essayé de mieu manipé si en plus j'amméliore mon ortho c'est du bonus.

[gorben]

Salut,

Tu migres a quelle vitesse? un beau gel s'obtient par une migration lente (souvent sur la nuit) Ton premier gel est bien, juste un peu trop d'ADN.
Le deuxieme ca peut etre trop d'ADN, et migration trop rapide.
Perso je crois pas trop a l'histoire des sels (mais ca reste quand meme une possibilite), puisque ton marqueur de PM aussi n'est pas top.

A+

[invitef5962f47]

Normalement on peut migrer à 100 - 130 V et obtenir de beau gels, enfin en tout cas je n'ai jamais eu de problèmes en migrant à ses voltages.

Personnellement ce genre de bandes me fait plus penser à des problèmes de concentration ou alors a des impuretés dans le gel. Tu as essayé avec une autre poudre d'agarose pour voir si ça faisait pareil ?

Mais bon c'est vrai que les bandes du deuxième gel sont vraiment bizarres, vu que toutes les bandes sont touchées (même celles du marqueur de poids moléculaire) ça vient à mon avis du gel.

[Flyingbike]

parler de voltage n'a pas trop de sens sans connaitre la distance entre les electrodes. Ce qui compte c'est la valeur du champ électrique en V.cm-1.

Tom problème ressemble a un problème de puits sales quand même...

[invite563835f6]

Il m'est arrivé d'avoir des bandes moches comme ça lorsque je m'étais planté de bleu de dépôt, j'avais utilisé du bleu de dépot de protéines (avec bétamercapto) pour migrer de l'ADN...
Mais bon, normalement le bétamercapto ça pue, on s'en rend compte quand on fait l'erreur..

[inviteb94d8e21]

Bonjour,

Pour moi c'est un échantillon surchargé (plusieurs ug d'ADN, vraisemblablement) avec une migration trop rapide et, peut-être, un problème de sels dans l'échantillon.

Trouble shooting :
Echantillon surchargé : on ne peut pas y faire grand chose quand on fait un gel préparatif, à part prendre un peigne avec des dents plus larges ou répartir l'ADN dans plusieurs puits. Ca a l'inconvénient d'augmenter la taille du morceau d'agarose qu'on découpe. J'essaye, en général, de ne pas avoir plus de 1ug d'ADN par bande d'intérêt pour une largeur de dent d'1cm.

Migration trop rapide: pour un gel analytique, on conseille 5V/cm maxi en TBE 1X (3-4V/cm en TAE 1X). Pour un gel préparatif, il peut être utile de se limiter à 0.5-1V/cm à 4°C (pour limiter la diffusion).

Sels dans l'échantillon: J'ai une fois résolu le problème par hasard en oubliant de mettre le courant après avoir chargé mon gel avec des échantillons que je savais chargés en sel. Les échantillons étaient sagement restés dans les puits pendant 4 heures et, pendant ce temps là, le sel avait eu le temps de diffuser dans le tampon. J'ai remis le courant et obtenu une super séparation avec des bandes bien droites.

Hope it helps.

[invite853321bf]

J'avais découvert par hasard (un oubli de jeter le gel quoi ) que laisser le gel "reposer" à l'air libre une trentaine de minutes après l'avoir révélé permettait d'améliorer aussi la qualité générale de la photo.
Et un profil comme la première image me fait penser à une migration trop rapide.
Petite question aussi : on ne voit pas ton front de migration.

[invite4ff72fd5]

J'avais découvert par hasard (un oubli de jeter le gel quoi ) que laisser le gel "reposer" à l'air libre une trentaine de minutes après l'avoir révélé permettait d'améliorer aussi la qualité générale de la photo.
Et un profil comme la première image me fait penser à une migration trop rapide.
Petite question aussi : on ne voit pas ton front de migration.

Ca c'est pas gagné à coup sur. Suivant le %age de ton agarose ça va diffuser et aussi suivant ta méthode de détection tu peux perdre du signal (sybr green sensible à la lumière)