Bonjour,
Je suis bloquée, j'ai un peu de mal avec les enzymes de restrictions et je comprend pas tout à fait ce que l'on me demande. Sachant que l'on veut un clonage orienté, on me demande de choisir les enzymes de restrictions utilisable du côté de la bordure portant la séquence du promoteur T7 sachant que le fragment d'intérêt contient un site SacII.
Si vous pouviez m'expliquer, merci d'avance
Salut,
Ton fragment d'intérêt contient un site SacII en son sein on est d'accord ? Pas en amont ou en aval ?
Si c'est bien le cas, cela signifie que tu ne peux pas utiliser SacII pour le clonage. En effet, le clonage va consister à amplifier ton insert avec des oligos de PCR portant des sites de digestion aux enzyme de restriction voulues. On ne veut donc pas que la digestion en question coupe ton insert en deux. Après PCR, il faut digérer l'insert d'une part, et le plasmide d'autre part. Ces digestions vont permettent de générer des bouts cohésifs entre l'insert et le plasmide. Il suffit alors de choisir deux enzymes de restriction (peu importe lesquelles a priori). Par exemple, on pourrait choisir les sites NotI (à placer en amont de ton insert) et EcoRI (à placer en aval de l'insert).
Je ne sais pas si j'ai été très clair, un schéma aurait été le bienvenu je pense, mais je n'ai pas vraiment la foi.
N'hésite pas à le dire si tu as besoin d'autres explications.
Il faut donc que je choisisse des enzymes présentes à la fois au niveau de la séquence T7 et SP6 ?
Je ne comprend toujours pas comment ça peut orienter l'insert ?
Pour le coup je pense qu'un schéma m'aiderais beaucoup.
Merci pour votre réponse.
