clonage/enzyme en dehors du site multiple de clonage

[inviteaf69fbdd]

Bonjour à tous, je vous sollicite pour une petite question. Lors d'un TP, j'ai inséré un fragment d'ADN dans un plasmide et derrière, pour vérifier la ligation, j'ai digéré le plasmide avec les 2 enzymes de restriction utilisé à la base et après migration sur gel il se trouve que au lieu d'avoir 2 fragments attendus (un fragment correspondant à mon plasmide et un fragment correspondant à mon insert) je n'ai qu'une seule bande.
Mon encadrant m'a donc dit de refaire une digestion contrôle en prenant une enzyme en dehors du site de clonage multiple (MCS) mais je ne vois pas à quoi cela va servrir?
Vérifier que le plasmide est superenroulé ?
D'avance merci pour votre réponse
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[invite2eb5a45f]

Il se peut que ton MCS ait été enlevé au cours du clonage (c'est normalement peu probable si tu as bien designé ton clonage). Il se peut également que le plasmide de départ soit muté et ne possède pas certains sites de restriction (également assez peu probable). Ou peut-être ta digestion n'a tout simplement pas fonctionné (problème de compatibilité enzymes/buffer, trop petit volume + évaporation, stock d'enzyme foutu si resté à température ambiante, etc)

Il est toujours bon de confirmer un tel résultat avec d'autres enzymes.

[inviteaf69fbdd]

merci pour votre réponse