Séquençage et métabarcoding

[invite3fc9ef70]

Bonjour,

Voila, je ne comprend pas trop comment choisir le type de séquençage à sélectionner. Le but est l'analyse de plantes inconnues grâce au DNA barcoding, à l'aide de marqueurs génétiques tels que rbcL ou trnL.
J'ai deux cas de figure :
Soit il y a une seule plante dans l'échantillon: après amplification par PCR, vient le séquençage. J'ai vu qu'il existait plusieurs types de séquençage : pyroséquençage, séquençage par synthèse, ..... qui diffèrent par le nombre de fragments obtenus, la longueur des fragments, le taux d'erreur, le coût d'analyse par séquence. Ce que je ne comprends pas, c'est que ces techniques ne me semblent pas adapté pour ce que je veux faire, puisque j'ai vu (sauf erreur) que la longueur maximale pouvant être séquencée est 700pb (avec le pyroséquençage). Hors, avec de tels marqueurs, j'ai besoin de séquencer de plus longs fragments, existe-t-il d'autres méthodes de séquençage ou celles que j'ai cité peuvent le faire ?

L'autre cas de figure est : il y a plusieurs espèces de plantes dans mon échantillon. Dans ce cas là, je dois obligatoirement utilisé le métabarcoding pour les séquencer et avoir la séquence de chacune des espèces ? Il me semble donc que dans ce cas, je doive trouver des marqueurs plus courts. Si je ne me trompe pas, ce type de séquençage va me donner un grand nombre de séquences et je me demande comment trier les résultats ensuite ? Existe-t-il des logiciels pour le faire ?

Enfin, une fois les séquences obtenues, je les compare à une base de donnée telle GenBank par exemple. Je peux le faire par internet ou grâce à des logiciels. Aussi, j'ai pour but de créer une base de données interne. Je me suis renseigner sur des logiciels pouvant faire tout cela à la fois. Seul Geneious peut le faire ?

Pour résumé, je me demande :
- Quel type de séquençage est le plus adapté lorsqu'une seule espèce est analysée (la précision du séquençage est importante, fragment de 1500 - 2000pb) ?
- Comment trier les résultats obtenus après séquençage en utilisant la méthode du métabarcoding ?
- Quels logiciels peuvent permettre à la fois le stockage des séquences ADN, la création de bases de données interne, la comparaison des séquences ADN avec des bases de données publiques, les alignements de séquences (à part Geneious) ?

Voilà, j'espère que vous avez des éléments de réponses à mes interrogations et avoir été suffisamment claire, sinon n'hésitez pas à demander des précisions.

Merci

Maako
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[invite3fc9ef70]

Bon je m'auto-réponds en partie ^^
En fait dans mon premier cas la meilleure méthode est le séquençage SANGER, qu'en pensez-vous ?

Aussi je me demandais, losque l'on commande des amorces chez un fournisseur, ils demandent quel niveau de pureté on souhaite (desalted, HPLC, ....) J'ai lu que la purification permettait d'éliminer les oligonucléotides tronqués. Est ce que ça sert seulement à ça ? Du coup pour une PCR classique (en point final), quelle est la purification la plus adaptée, parce que les prix montent vite ^^ ?

Merci d'avance pour votre aide

Maako

[invite2eb5a45f]

Je ne connais pas tes marqueurs donc je vais passer mon tour sur cette question.

Ce qui est certain, c'est qu'à l'heure actuelle, le pyro séquençage est la méthode de séquençage qui produit les "reads" les plus longs (même si on ne peut pas parler de reads à proprement parler, puisqu'on ne séquence qu'un seul produit de PCR par cette méthode). Il y a bien les techniques issues de la technologie nanopore (minION, développé par Oxford Nanopores), mais elles sont encore peu utilisées et leur fiabilité n'est pas clairement reconnue à l'heure actuelle.

Si tes échantillons sont barcodés, cela signifie simplement que chaque read possède une séquence spécifique en début de read, qui ne fait pas partie du génome de ton organisme mais qui a été ajouté pour différencier les individus de ton échantillon. Si on utilise le barcoding, c'est a priori pour faire du séquençage à haut débit (mais c'est un peu stupide de faire du séquençage à haut débit si tu utilises des marqueurs). Bref, je comprends pas trop où va ton expérience. Soit tu as une information très précise à obtenir, sur un nombre limité de séquences, et tu fais du pyro-séquençage. Soit tu cherches à avoir une vision plus globale de ton génome et tu passes par du séquençage à haut débit (et après le choix de la méthode de séquençage à haut débit dépend des informations recherchées).

En ce qui concerne la question de ton dernier post, des oligos dessalés suffisent pour une PCR normale (c'est même la seule utilisation ou presque pour laquelle cela suffit).

[invite3fc9ef70]

Bonjour,

Tout d'abord, merci pour vos éléments de réponse. Je vais ajouter quelques précisions à ma problématique.

Si tes échantillons sont barcodés, cela signifie simplement que chaque read possède une séquence spécifique en début de read, qui ne fait pas partie du génome de ton organisme mais qui a été ajouté pour différencier les individus de ton échantillon. Si on utilise le barcoding, c'est a priori pour faire du séquençage à haut débit (mais c'est un peu stupide de faire du séquençage à haut débit si tu utilises des marqueurs). Bref, je comprends pas trop où va ton expérience.

En fait, dans le "DNA Barcoding" ce sont des séquences du génome qui sont utilisées comme barcode. Les marqueurs sont donc choisis avec soins (ici rbcL et trnL) pour permettre d'identifier les espèces. Je m'explique : ce sont des régions du génome qui sont (en théorie) variables d'une espèce à une autre, mais très préservées au sein d'une même espèce, pour lesquelles des amorces dites "universelles" ont été design. Cela signifie que, en ne connaissant pas notre échantillon, les amorces vont quand même matcher (puisqu'universelle) et permettre une amplification. Le but étant de séquencer la zone d'intérêt (avec les même amorces). L'identification de l'espèce se fait après le séquençage, non pas selon la longueur du fragment amplifié, mais bien selon sa séquence.
Cette technique est assez aboutit chez les animaux, avec pour marqueur COI, le gène codant pour la cytochrome oxydase, sous unité I.

L'idée c'est d'identifier des espèces selon leur génome, à partir d'échantillons inconnus. Lorsqu'il y a un seul organisme dans l'échantillon, après séquençage, comme celui de sanger, on obtient une séquence "nette". Mais si il y a plusieurs espèces dans l'échantillon, on obtient une superposition des deux séquences, donc c'est illisible. Je sais qu'il existe alors la méthode du métabarcoding, qui consiste à séquencer chaque brin individuellement, ce qui permet de connaitre chaque séquence présente dans l'échantillon. Cependant, je ne sais pas comment trier toutes ces séquences (regrouper celles qui sont identiques), parce qu'il y en aura des millions et sans bioinformatique, c'est impossible. Mais je ne sais pas du tout comment cela se fait .... d'où ma question : "Comment trier les résultats obtenus après séquençage en utilisant la méthode du métabarcoding ?"

C'est aussi pour ca que je compare mes séquences avec des bases de données (pour les identifier) et que je souhaite avoir ma propre base de données : "Quels logiciels peuvent permettre à la fois le stockage des séquences ADN, la création de bases de données interne, la comparaison des séquences ADN avec des bases de données publiques, les alignements de séquences (à part Geneious) ?"

En espérant avoir été plus claire ^^
Maako

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2eb5a45f]

Ah ouai okay. C'est juste que pour moi le barcoding c'est ce que tu appelles "métabarcoding". Du coup si tu fais du barcoding selon tes termes, c'est séquençage Sanger, dans les deux sens. J'ai regardé un peu la rbcL; on est dans les 480 acides aminés c'est ça ? 1440 nucleotides, en faisant du Sanger dans les deux sens on est pas mal. T'auras peut-être pas tout , mais ça sera suffisant.

sans bioinformatique, c'est impossible

Oui, c'est pour ça que les gens qui font de l'analyse de séquençage à haut-débit ont fait un master de bioinformatique ou un stage - au moins - dans le domaine.

Il n'y a pas de logiciel universels. C'est à toi de procésser les données, assembler les reads, les mapper au génome de référence. Il y en a pour plusieurs semaines pour quelqu'un d’expérimenté.

Et d'ailleurs, le barcode ne permet pas d'identifier les espèces dans un mélange. Le barcode c'est toi-même qui l'introduit. Le principe ici est de mixer plusieurs échantillons et les séquencer en même temps pour diminuer les couts de séquençage. Dans un second temps on sépare les expériences selon leur barcode in silico.

On peut effectivement faire un séquençage massif d'une "soupe" de plusieurs organismes pour identifier les espèces dans la soupe, mais c'est difficile. Et pour justifier le cout d'une manip de séquençage haut débit pour identifier des espèces... Faut avoir de l'argent à gaspiller ou avoir une sacrée bonne raison.

Bref, on ne se lance pas dans le séquençage haut-débit comme ça tout seul.

[invite2eb5a45f]

Désolé, je viens de vérifier, le metabarcoding est effectivement différent du barcoding des reads et correspond donc à ce que j'ai appelé "séquençage de la soupe".

Ca change rien à ma conclusion sur le séquençage massif cela dit.

[invite3fc9ef70]

Oui c'est bien ça.
D'accord, donc si je veux faire ce type d'analyse, il faudra que je fasse sous-traité la bio-informatique.

Et d'ailleurs, le barcode ne permet pas d'identifier les espèces dans un mélange. Le barcode c'est toi-même qui l'introduit. Le principe ici est de mixer plusieurs échantillons et les séquencer en même temps pour diminuer les couts de séquençage. Dans un second temps on sépare les expériences selon leur barcode in silico.

Si je ne me trompe pas, ce n'est pas du multiplexage ?

A noter que pour ce que j'appelle le metabarcoding (parce que c'est son nom), je n'ajoute aucun barcode. Les différents fragments obtenus sont trier selon les séquences lues et non selon des étiquettes ajoutées.

En tout cas vous avez bien compris, c'est exactement pour le cas ou j'ai une "soupe" ! J'imagine bien que du coup ça doit être assez cher. Est ce possible de s'en sortir en insérant les fragments dans des plasmides ? Mais là aussi ça doit être assez coûteux.
Ne vous inquiétez pas, je ne me lance pas seule dans le haut débit, je me renseigne seulement des limites de ces méthodes selon ma problématique, il faut bien apprendre Et puis, il y a une différence entre la faisabilité selon le coût, et le fait que ce soit possible techniquement.

Maako