Probleme de genotypage

[kaaylim]

Bonjour a tous,

J'ai des difficulte pour etablir un protocole afin de differencier les souris KO homozygotes et heterozygotes.
Malheuresement je n'ai pas de grande experience en biomol.

Le probleme est le suivant:



Une Neo K7 remplace l'exon 2 afin de generer le KO.
Ces souris ont ete croises avec une lignee qui ont un transgene contenant EGFP a la place de l'exon 1 pour identifier les cellules en question.
Maintenant, pour le genotypage cela pose un probleme car si je fais une PCR sur autour de l'exon 2, les KO ont aussi cette region via le transgene.

Il faudrait que je fasse un PCR de l'exon 1 a l'exon 2 mais ils sont trop eloignes l'un de l'autre...

Auriez-vous des suggestions?

Merci Beaucoup!
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[Flyingbike]

c'est pas très clair : le KO est en fait un KI d'une cassette néo, ok, mais le tg EGFP il est inséré ou ? dans l'exon 1 du même gène ?

le but est d'avoir des WT avec les deux exons, et des KO avec EGFP a la place de l'exon 1 et K7 à la place de l'exon 2 ?

[kaaylim]

Merci pour la reponse.

c'est pas très clair : le KO est en fait un KI d'une cassette néo, ok, mais le tg EGFP il est inséré ou ?

EGFP a ete insere autre part, avec un BAC contenant ce meme gene. Il remplace dans ce transgene l'exon 1.

le but est d'avoir des WT avec les deux exons, et des KO avec EGFP a la place de l'exon 1 et K7 à la place de l'exon 2 ?

Oui, pour identifier les cellules qui l'exprime en temps normal.
Le probleme c'est pour differencier les KO et les souris qui n'ont qu'un seul allele avec la casette NEO car elle ont une autre copie du gene avec EGFP, autre part.

Suis-je plus clair?

[Flyingbike]

la stratégie est plutot étrange....

Du coup, les WT on deux copies des deux exons (WT/WT)
vos KO idéales sont en fait hétérozygotes (K7/EGFP)?!

mais vous allez avoir des hétérozygotes WT/EGFP...?

Le moyen le plus simple que j'envisage c'est du génotypage quantitatif sur l"exon 2

1n : KO
2n : WT

[A voir en vidéo sur Futura]

[kaaylim]

Oui, la strategie est plutot etrange, ils ont fait avec ce qu'ils avaient...

En fait les KO/wt (les KO/KO n'atteignent pas le stade adulte) ont ete croises avec les reporter EGFP (insertion aleatoire, en multiples copies)

On a donc
KO/wt; EGFP+
KO/KO; EGFP+
wt/wt; EGFP+

Une PCR quantitative sur l'exon 2 n'est pas ideale a cause de la multiple copie du gene-EGFP (qui contient aussi l'exon 2). Mais sur la casette NEO effectivement oui.

[Flyingbike]

ah oui c'est un transgène !!
c'est pas simple...

du coup avec la quantitative sur K7 vous pouvez discriminer les 3 génotypes, si j'ai bien suivi :/