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Extraction ARN




  1. #1
    FMouna

    Extraction ARN

    Bonsoir,
    Je suis entrain d'optimiser une extraction d'ARN chez le chêne Liège. J'ai essayé un kit commercialisé mais la pureté et le rendement en ARN est très faible! J'ai trouvé ds un article un kit maison, il utilise du glycogene pour précipiter l'ARN! Est ce que qlq'1 connaît un autre produit pour substituer le glycogene?
    Merci d'avance pour votre réponse

    -----


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  3. #2
    Flyingbike

    Re : Extraction ARN

    Tout ce que le glycogène fait c'est co-précipiter l'ARN. Je ne connais rien qu'on puisse utiliser à la place, mais surtout ce n'est pas ça qui changera radicalement le rendement.

    Je n'ai jamais fait de BV, mais avez-vous essayé une extraction au thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme (trizol, RNAplus, etc...) ? Le rendement est plutôt bon et ce n'est pas très cher.

    Ce qui peut limiter l'extraction c'est : la quantité de matériel de départ, la qualité de la lyse cellulaire, la concentration relative en ARN
    La vie trouve toujours un chemin

  4. #3
    Loupsio

    Re : Extraction ARN

    protocole Trizol marche bien en veg , sinon CTAB pour les récalcitrantes (genre riches en phenols) et si malgré ca tes ratios sont toujours mauvais, après l'extraction passe par une purification phenol-chloroforme et précipitation a l'ethanol


  5. #4
    FMouna

    Re : Extraction ARN

    Merci pour votre réponse et recommandations!
    Normalement le protocole que je voudrais utiliser c le CTAB mais vers la fin il faut ajouter le glycogene pour précipiter l'ARN!
    si vous pourrez me passer ce protocole avec CTAB pour que je puisse le comparer à le mien et l'utiliser! Merci infiniment

  6. #5
    FMouna

    Re : Extraction ARN

    Merci pour votre réponse
    J'utilise normalement soit trizol ou des kits commercialisés mais c'était pour des plantes herbacées! C la première fois que je travaille sur le chêne!! J'ai fait une première extraction avec un kit auquel j'ai ajouté au début du PVP mais j'ai eu un rendement très faible avec un ratio 280/260 et 230/260 a peine 1.4??
    J'ai trouvé un kit maison avec di CTAB mais à la fin ils utilisent le glycogene!! Or j l'ai pas au labo!

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Tibosax

    Re : Extraction ARN

    On l'a dit plus haut : le glycogène ne fait pas précipiter l'ARN ! Il co-précipite avec l'ARN, ce qui rend le culot plus facilement identifiable et évite de le perdre, c'est tout. Le glycogène n'est jamais indispensable.

  9. #7
    FMouna

    Re : Extraction ARN

    Merci pour les éclaircissement

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  11. #8
    Flyingbike

    Re : Extraction ARN

    Rendement = quantité d'ARN extraite / quantité théoriquement disponible

    Vous avez combien de matériel de départ ? Quelle concentration ? Quel volume ?

    1,4 c'est pas la fin du monde. En général rendement et pureté ça ne va pas dans le même sens !!
    La vie trouve toujours un chemin

  12. #9
    FMouna

    Re : Extraction ARN

    Matériel de départ = 30mg
    [ARN]= 40ng/ul
    1,4 ca veut dire qu'il ya contamination protéique!! Je pense que c pas bon pour la suite! Non??

  13. #10
    Tibosax

    Re : Extraction ARN

    C'est quoi la suite ?

    Tu peux essayer de refaire un Trizol par dessus pour te débarrasser des protéines... Tu vas re-perdre un peu d'ARN forcément, mais niveau pureté on devrait se retrouver vers quelque chose d'un peu plus optimal déjà.

  14. #11
    Flyingbike

    Re : Extraction ARN

    Oui c'est quoi la suite ? Ça ne veut pas dire obligatoirement que tu as une contamination protéique. Et pour bien des applications c'est pas la fin du Monde...
    La vie trouve toujours un chemin

  15. #12
    Loupsio

    Re : Extraction ARN

    sinon faire un mélange avec "methanol-chloroforme" (récupérer la phase supérieur) suivi d'un mélange "chloroforme" (récuperer la phase supérieur) suivi d'une précipitation à l'acetate de sodium et ethanol (0.3M finaux d'acetate de Na, avec 2.5V de ethanol 99%, une heure a -20° , centrifuger récupérer le culot et le laver avec 250 microlitres ethanol 70%, centrifuger evacuer l'ethanol et resuspendre en eau-DEPC ) permet normalement d'avoir une bonne qualité d'ARN sans trop de pertes

  16. #13
    Flyingbike

    Re : Extraction ARN

    Citation Envoyé par Loupsio Voir le message
    sinon faire un mélange avec "methanol-chloroforme" (récupérer la phase supérieur)
    Phénol plutot ?
    La vie trouve toujours un chemin

  17. #14
    Loupsio

    Re : Extraction ARN

    Euh oui phénol pardon, c'est ce que je disais plus haut,
    Merci d'avoir corrigé, j'ai écris un peu rapidement

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