PCR sur colonie après insertion chromosomique... ?

[invite8262d7ce]

Bonjour,

Aujourd'hui en TP, j'ai fais une électroporation d'un fragment d'ADN linéaire dans des bactéries (DY330, ayant un système RED augmentant l'activité de recombinaison homologue).
Cet ADN linéaire possède de part et d'autre, donc, des régions homologues qui permettront son insertion dans le génome bactérien. Entre les deux régions se trouve une étiquette TAP et un gène de résistance à la kanamycine (concrètement, le but du TP est de produire une protéine étiquetée TAP). Une fois éléctroporées, j'ai étalé mes bactéries sur une boite LB + kanamycine.

Mais on nous demande ensuite de réaliser une PCR sur colonie pour analyser les transformants. Le primer direct s'hybridera sur la séquence codante de la protéine (côté génome bactérien), tandis que le primer reverse s'hybridera sur la séquence TAP (fragment inséré). Ainsi, si il y a eu recombinaison homologue et insertion dans le génome, la PCR fonctionnera. Si il n'y a pas eu de recombinaison, il n'y aura pas de PCR.

Cependant, ce que je ne comprends pas, c'est que j'ai à la base étalé après électroporation mes bactéries sur un milieu contenant la kanamycine. Théoriquement, les bactéries qui y poussent devraient donc avoir intégré par recombinaison homologue TAP + Kan dans leur génome non ?
Quel est l'intérêt ici de faire une PCR sur colonie alors, sachant que celles qui sont sur ma boite ont fait la recombinaison ?


Merci de votre aide ! )
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[invite2eb5a45f]

Ça c'est la théorie. En pratique, il arrive que l'insertion se fasse à un autre endroit du génome. La probabilité est faible comparé au site idéal, mais elle existe. Et l’inconvénient avec une souche dont la recombinaison homologue est stimulée, c'est que cela favorise les justement off-targets (évènements de recombinaison indésirables).

[Loupsio]

Bonsoir
Tu n'es jamais sur de ce qu'il y a dans tes boites, il y a de nombreuses bactéries possédant des résistances antibiotiques, pour peu que tu ais manipulé du mieux possible mais qu'une bactérie qui ne vienne pas de ton étalement se soit retrouvé dans ta boite de pétri, tu as peut être une bactérie résistate a la kanamycine et qui ne vienne pas de ce que tu as transformé, qui se soit retrouvé en culture

deuxièmement, les mutations spontanées ça arrive, alors même si tu était en milieu stéril ++ et qu'aucunes bactéries externes ne s'est retrouvée dans ta boite, il y a tout de même un risque (très faibles, certes) que une de tes bactérie electroporée mais pour laquelle la transformation aurait pas réussi (donc qui ne contiendrai pas ton gène) se retrouve spontanément résistantes à la kanamycine (sans lien avec les résistances que tu insère avec ton ADN linéaire)

Voila deux raisons de faire ta colony PCR

EDIT, Ah oui et il y a aussi comme Tibosax l'explique la possibilité que ca soit pas intégré au bon endroit, ducoup ta bactérie aurait la résistance mais pas le construct, ducoup vu que tes amorces sont sur deux parties du génome qui seront éloignées, pas d'amplification.

[invite8262d7ce]

Waaa d'accord, je n'avais pas pensé à ça du tout !
Je comprends maintenant en effet !!


Merci énormément en tout cas, je pourrais analyser ma colony pcr l'esprit tranquille

[A voir en vidéo sur Futura]