Différence shARN, miARN et siARN

[Meiosis]

Bonsoir,

J'ai un petit doute.
J'aimerais savoir si ce que je dis est vrai.

siARN et shARN = pas naturellement présents dans les organismes, ils sont synthétisés en laboratoire.
siARN = transfection transitoire, ils restent dans le cytoplasme pour réduire/supprimer la traduction des ARNm cibles.
shARN = transfection stable, ils s'intègrent dans le génome de la cellule hôte (avec possibilité de le mettre sous le contrôle d'un promoteur donné pour réguler son expression).

miARN = exprimés naturellement dans différents organismes.

Merci à vous.
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[invite82acfce6]

Salut,

Tu le sais probablement mais au cas où : l'intégration d'un shARN dépend de la nature du vecteur utilisé.

Perso tout me semble ok...

[Meiosis]

Salut et merci pour ta réponse.

Sinon concernant l'intégration non je ne suis pas au courant. Tu veux dire que parfois l'ADN codant pour le shARN ne sera pas intégré dans le génome et restera dans le cytoplasme ?

[invite82acfce6]

Wikipédia : Une variété de vecteurs viraux peuvent également être utilisés pour obtenir l'expression des shRNA, notamment les AAVs, virus artificiels dérivés des adénovirus et les lentivirus. Avec les adénovirus le vecteur reste épisomal, c'est-à-dire qu'il ne s'intègre pas dans le génome de la cellule ciblée. Cette particularité est avantageuse car elle permet d'éviter le phénomène de mutagenèse insertionnelle. À l'inverse, cette particularité a aussi ses désavantages car la descendance de la cellule va rapidement perdre le virus par dilution à moins que les cellules infectées ne se divisent très lentement. La différence entre les AAVs et les adénovirus réside dans le fait que les AAVs ne possèdent plus de gènes viraux et ont une capacité d'encapsidation réduite. Les lentivirus, quant à eux, intègrent le shRNA apporté dans des portions transcriptionnellement actives de la chromatine. Ainsi le shRNA apporté sera transmis à la descendance de la cellule. Avec cette approche le risque de mutagenèse insertionnelle augmente, cependant ce risque peut être réduit en utilisant des lentivirus possédant une intégrase déficiente.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Meiosis]

Mais dans le cas où il ne s'intègre pas, comment peut-il être transcrit puisque l'ARN polymérase 2 est confinée dans le noyau des cellules hôtes ?

[invite82acfce6]

Bah je suppose qu'il pénètre dans le noyau sans s'intégrer au génome, non? Comme le font plusieurs virus.

[Meiosis]

Je pensais que le matériel restait dans le cytoplasme, ça règle donc le problème, merci à toi.

[invite82acfce6]

Après il me semble qu'en général, pour de nombreux vecteurs, peu de molécules pénètrent effectivement dans le noyau. De plus, certains vecteurs viraux ne peuvent pénétrer dans le noyau que lors de la mitose (pas toujours le cas en culture cellulaire).

Mais même sans vecteur, on peut injecter de l'ADN exogène, en tout cas je sais que ça a été fait avec des ovocytes de xénope. Donc il faut forcément pénétrer le noyau pour que la transcription est lieu.

[Meiosis]

Je te remercie pour ces informations complémentaires.

[Flyingbike]

Mais dans le cas où il ne s'intègre pas, comment peut-il être transcrit puisque l'ARN polymérase 2 est confinée dans le noyau des cellules hôtes ?

Précision : en général pour les petits ARN comme les sh, on prend un promoteur polymerase III comme le U6

[Meiosis]

Précision : en général pour les petits ARN comme les sh, on prend un promoteur polymerase III comme le U6

Mais disons si je veux faire exprimer mon shARN uniquement dans un tissu précis (le rein) et uniquement quand une protéine précise est transcrite (par exemple l'aquaporine 2), je devrais utiliser un promoteur d'ARN polymérase 2 vu que l'aquaporine 2 est transcrite par l'ARN polymérase 2 (comme tous les ARNm), non ?

L'ARN polymérase 3 c'est juste si on veut qu'il soit transcrit tout le temps si j'ai bien compris, sans contrôle spatial/temporel à l'aide d'un promoteur.

[Flyingbike]

dans ce cas on fait plutot un KI en général

mais je ne vois pas le lien entre la pol. de l'Aquaporine et celle du sh, a moins que tu parles d'exprimer un sh sous le contrôle du promoteur de l'aquaporine ? Il n'y a pas de raison que ça ne soit pas possible, j'ai juste eu quelques lectures précisant que l'expression d'un sh est plus performante avec un promoteur polIII que polII (mais ça fonctionne avec un promoteur polII, comme le CMV par exemple, donc pas de raison)

[invite82acfce6]

Petite précision (après quelles lectures rapides également) : apparemment, on utilise de moins en moins des promoteurs Pol III, qui permettent une expression continue, car l'excès de shRNA a des effets cytotoxiques.

ps : pas lu, mais le sujet est traité ici, à partir de la page 106. Et là, un diaporama.

[Meiosis]

dans ce cas on fait plutot un KI en général

mais je ne vois pas le lien entre la pol. de l'Aquaporine et celle du sh, a moins que tu parles d'exprimer un sh sous le contrôle du promoteur de l'aquaporine ? Il n'y a pas de raison que ça ne soit pas possible, j'ai juste eu quelques lectures précisant que l'expression d'un sh est plus performante avec un promoteur polIII que polII (mais ça fonctionne avec un promoteur polII, comme le CMV par exemple, donc pas de raison)

KI = knock-in ?

Si oui c'est ce que je veux dire, une fusion transcriptionnelle avec la construction [promoteur aquaporine 2]-[shARN]
J'ai pris l'aquaporine 2 mais j'aurais pu prendre n'importe quelle protéine, je voulais juste comprendre la différence entre l'utilisation d'un promoteur d'ARN pol III et II.

Apparemment je suis dans le bon d'après tic-tic :

promoteur de pol III = expression continue/constitutive du shARN + contrôle spatial de son expression impossible
promoteur de pol II = expression régulée (transcrit en même temps qu'une autre protéine donnée) + contrôle spatial possible