Problème de migration SDS-PAGE

[fatima28100]

Bonjour,

j'étudie la capacité de renaturation (qui semble se faire de manière spontanée) de deux protéines, et j'utilise l'électrophorèse SDS-PAGE comme méthode d'analyse.

L'expérience consiste, dans un premier temps, à dénaturer les protéines dans de l'urée 8M + DTT 5mM, puis à les renaturer par l'utilisation d'un tampon (TrisHcl, NaCl et EDTA), une centrifugation est ensuite réalisée, le surnageant correpondant à ma fraction soluble est concentrée par evaporation et mon culot correspondant à ma fraction agrégée est resuspendu dans un peu de tampon de dénaturation (Urée 8M + DTT 5mM) et Laemmli Buffer 5X.
Je dépose donc ma fraction totale (2uL de protéine stock + 18uL de Laemmli Buffer 5X), ma fraction soluble concentré qui est resuspendu dans du Laemmli Buffer 5X, et mon culot.

Je fais migrer mes fractions sur un gel SDS-PAGE 15%, la migration ne migre pas droite par rappport à mon marqueur de taille, j'ai des trop grosse bande (non du à la quantité de protéine déposée) qui déborde c'est assez bizzarre auriez-vous une solution à mon soucis ?

En vous remerciant par avance.
-----

[flo_w13]

Bonjour,
Différentes hypothèses :
- la quantité de polyacrylamide dans ton gel (15%) est peut être trop élevée
- la quantité de Laemmli déposée est trop grande : tu dis qu'il est 5X et pourtant tu en mets 18µL dans un volume final de 20µL
- quel est la composition de ton tampon de migration? combien de volt? combien de temps ?

[fatima28100]

Bonjour,

je vous remercie pour votre réponse.

Je me dois d'utiliser un gel 15% car j'ai une protéine de 15kDa​ j'avais du mal à voir avec une gel 12%.

Je suis d'accord pour le Laemmli les ratios doivent être de 50% d'échantillon et 50% de Laemmli c'est ça ?




Le tampon de migration est composé de Tris-Base, Glycine et de SDS 20%. Je mets à migrer à 180V pendant 45min environ.

[flo_w13]

Si les ratios étaient de 50% chacun, cela signifierait que votre Laemmli est à 2X. Si vous voulez préparer une solution de volume final de 10µL par exemple, il faudra ajouter 10/5=2µL de bleu de laemmli, et complétez jusque 10µL avec vos échantillons dilués à la bonne concentration

[A voir en vidéo sur Futura]

[fatima28100]

Bonjour,
il semble que j'ai résolu le problème qui n'était autre que l'urée !!!! En effet je dénature avec de l'Urée 8M puis renature avec un tampon (TrisHCL, NaCL, EDTA) puis je concentre ma protéine par evaporation, l'urée reste donc à trés forte concentration à la fin de l'évaporation. J'ai testé hier la précipitation au TCA et après migration de mes échantillons les bandes migrent parfaitement