Immunologique: test du type ELISA

[invite6e634b1e]

Bonjour tout le monde,

J'aurais une question pour mon cours d'immunologie.

Lorsque l'on fait un test immunologique, je ne comprends pas l'utilité d'utiliser 2 antigènes.
Imaginons que je cherche la protéine "X". Et bien, je vais devoir utiliser un antigène "Ya" qui détecte la protéine "X" et c'est seulement par la suite que je mets un 2e antigène (disons "Yb") qui possède une molécule fluorescente pour qu'il se fixe sur l'antigène "Ya". Pourquoi ne pas mettre simplement l'antigène "Yb"?

En gros, pourquoi utiliser un antigène pour détecter ma protéine et un 2e antigène pour détecter les antigènes précédemment mit ?
Ne serait-il pas plus facile de mettre le premier antigène avec molécule fluorescente et donc on évite ainsi 2 étapes? Pourtant si on le fait c'est qu'il doit y avoir une raison, mais je ne trouve pas. ^^
Il y a ici sur internet un schéma qui montre bien ce que je veut dire:
http://www8.umoncton.ca/umcm-gauthie...teccompter.gif

Je vous remercie par avance,
Bien à vous,
MrGomki
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[Flyingbike]

au lieu d'antigene vous voulez probablement dire anticorps...

[invite6e634b1e]

Bonjour,

Euh oui c'est ça, je voulais dire anticorps.

Désolé ^-^

Alors quelqu'un peut m'aider?

[invite9dc7b526]

Si tu mélanges un cocktail de protéines et un anticorps fluorescent, qu'ils s'accrochent ou pas tu verras la fluorescence.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6e634b1e]

Oui, mais ce que je ne comprends pas c'est pourquoi faut-il mettre un premier anticorps "A" pour repérer la protéine et un 2e anticorps "B" pour détecter l'anticorps avec la protéine.

[vpharmaco]

Pour continuer sur la terminologie:
Ya = anticorps primaire
Yb = anticoprs secondaire/

On peut faire des ELISA directs, en marquant directement l'Ac primaire. Par contre, cela suppose que pour chaque protéine à doser, il faille developper un Ac primaire marqué (en croisant les doigts pour le marquage fluo, HRP, etc ne nuisent pas à l'affinité ou sélectivité). Si l'on veut changer de méthode de détection, il faut recommencer et produire un nouvelle Ac primaire marqué.

C'est pour cela que le plus souvent on fait des ELISA indirect. Les Ac primaires sont optimisés pour atteindre la meilleure affinité et selectivité possibles pour leur antigène cible. Les Ac secondaires sont optimisés pour leur capacité à se lier aux Ac primaires et donner le max de signal. Ils ciblent des régions communes des Ac primaires donc un seul Ac secondaire peut être utilisé pour détecter plusieurs types d'Ac primaires. Si l'on veut passer d'un marquage fluo à un marquage chimiluminescent, il suffit de changer d'Ac secondaire.

Il existe aussi un phénomène d'amplification: Plusieurs Ac secondaires peuvent se fixer sur un seul Ac primaire. Il en résulte un gain de signal qui améliore la sensibilité.

[invite6e634b1e]

Aaaah ok!!!

Merci beaucoup pour ta réponse!

Bonne journée,
MrGomki

[Flyingbike]

c'est pas tout à fait ça.
Dans beaucoup d'ELISA il y'a un anticorps dit de capture qui permet de capturer la protéine d'intérêt dans le puits. Tout le reste est lavé
Le second anticorps, de détection, permet de quantifier ce qui a été capturé.

[vpharmaco]

ah oui, j'avais çà en tête mais ce n'est peut etre pas de cela qu'il était question... https://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A...SA_en_sandwich

[Flyingbike]

oui en effet

l'ELISA sandwich est du coup très modulable et plutôt sensible. On n'utilise pas de secondaire au sens western blot ou IF, mais uniquement un Ac de détection biotinylé (puis streptavidine HRP) par exemple