Bonjour,
Je dois mettre en place une méthode de détection des protéines hydrolysées, et je pense avoir trop peu d'informations dans mon protocole. Mes matrices sont des échantillons d'aliments pour animaux (ruminant, porcs...)
Préparation du tampon d'échantillon : 2.5ml Tris-HCL pH6.8, 2 ml Glycérol, 1 mg de bleu de bromophénol, 0.4g de SDS 1 ml de béta mercaptoéthanol --> compléter à 10ml . Cette partie OK
Préparation d'échantillon protéiques : échantillon + Urée 8M chauffé 15 min à 65°C --> masse et volume inconnues.
Puis diafiltration avec vivaspin 6 (30KDa) : 2.5ml d'échantillon +2.5 ml Urée 8M. Centrifuger 10 min à 4000g. Compléter à 5ml avec Urée 8M, centrifuger 10min à 4000g. Répéter 3 fois. Jusqu'à obtenir 0.2-0.3ml d'extrait.
Je sais que l'urée dénature les protéines, mais l'utiliser autant de fois est-ce vraiment nécessaire ? Je me disais que la filtration devrait plutôt se faire avec du Tris-HCL (je ne dispose pas d'autre Tampon) ? Qu'en pensez-vous?
J'ai fais des premiers essais en pesant 0.1g de protéines hydrolysées +5ml d'urée 8M--> la centrifugation est interminable. ça colmate, du coup le liquide ne s'évacue pas. Même en montant à 10000g c'est long. Sachant qu'il y a plusieurs cycles de centrifugation, si le premier est hyper long...
Je n'ai que peu d'élément avec moi, mais si au moins vous avez quelques pistes, je suis preneuse.
Merci d'avance.
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