surproduction et purification de proteine

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bonjour a tous

je suis entrain de surproduire la topoisomerase topI de campylobacter jejuni grace a une induction a l 'itpg la je vais entamer ma purification j ai quelaue idees pour mon protocole mais est ce que y a des personnes qui ont deja fait de la purif de proteine j aimerai avoir un apercu pour precider ma purification c est par un his tag

et est ce que y a parmi vous qui ont deja utiliser un inhibiteur de protease c est un cooktail de chez sigma je vous joins le lien
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/...g=fr&region=CA
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Bonjour Nadia,

J'ai produit pendant ma thèse deux protéines du parasite Plasmodium chez E. coli (des top10). Voici ce que je peux partager comme idées :

_ j'imagine que tu produis chez E. coli. Le gène de ta protéine est-il une version optimisée ou harmonisée ? Je précise la différence au cas où :
* optimisée * c'est choisir pour chaque codon celui qui est le plus utilisé chez l'organisme qui exprime (exemple, à telle position il y a une leucine dans ta séquence, eh bien tu choisis le codon leucine le plus retrouvé chez E. coli).
* Harmonisée * admettons que chez jejuni, un codon précis de l'ARN de ta protéine d'intérêt soit très peu retrouvé dans tout le transcriptome de jejuni (exemple, j'invente, on parle du codon CUG qui est très peu utilisé pour coder une leucine). Eh bien tu ne vas pas choisir le "meilleur" codon leucine chez E. coli pour ton transgène, mais celui dont la fréquence d'utilisation est proche de celle de chez jejuni. Si ce codon CUG n'est retrouvé que parmi 5% des codons qui correspondent à la leucine chez jejuni, alors il faudra trouver - autant que possible - un codon leucine qui n'apparaît que dans 5% des cas chez E. coli. Pour ma prot de thèse, passer d'une version optimisée à harmonisée m'a permis d'obtenir une protéine bien plus stable.

_ Pour les tampons à utiliser je préfère laisser la parole à qqn d'autre, j'ai produit de la protéine transmembranaire alors c'était très particulier je pense les tampons que j'ai utilisés !

_ Mes protéines aimaient être dans de l'HEPES mais pas du MOPS. Il faut que tu testes différentes sauces pour que ta prot soit contente (j'espère que tu as de la biblio sous le coude à propos de ce qu'aime ta topoisomérase pour pas partir à l'aveugle)

_ J'utilisais effectivement ces pastilles inhibitrices de protéases de chez Sigma. J'avoue n'avoir jamais comparé avec et sans, je me suis contentée d'en mettre absolument partout pendant ma purif.

_ Les grandes lignes de mon protocole de purif de ma prot (sachant que je congelais mes culots de bactéries transformées de 500 mL de culture, visuellement c'était un peu moins que le volume de l'extrémité conique d'un Falcon 50) : un culot + 25 mL de tampon, reprendre doucement, sonication 7 min à 150 V dans la glace pour casser les cellules, centri 30 min 35000 rpm 4°C, surnageant chargé sur colonne Ni-NTA de 2 mL équilibrée avec le tampon. Pour débarrasser ma protéine des acides nucléiques qui y étaient liés (peut-être auras-tu ce soucis également), je faisais d'abord un pic de NaCl (10 mL de 300 mM à 2M puis de 2M à 300 mM), lavage de la colonne avec 20 mL de tampon. Elution avec un gradient d'imidazole (20 mL de 0 à 250 mM). Avec bien sûr ton HPLC qui te distribue des fractions de 1 mL par exemple.

_ Attention à tout ce que je raconte : je ne connais rien de ta protéine (taille, composition, stabilité, etc), j'insiste sur le fait que je parle d'une protéine transmembranaire de Plasmo. Je n'ai pas assez de recul et d'expérience pour te donner les grandes lignes d'une purif de protéine His-taggée.

_ Il faut naturellement que tu regardes ce que tu as dans tes fractions avec des gels colorés mais pour une purif de nouvelle prot faut absolument que tu fasses un Western Blot pour vérifier ce que tu vois et où, avec un anticorps anti His.

En espérant t'être utile,
Dalmia