Gène de ménage (gène de référence...)

[invitefccca761]

Bonjour bonsoir !

Aujourd'hui en cours on a vu les gènes de référence. Et j'avoue que je suis perdue haha
En fait, plusieurs questions me viennent à l'esprit :

- Déjà... pourquoi ? Je veux dire, à quoi ça sert ?
- Et ensuite... Comment ? J'ai compris que l'on devait choisir un gène qui ne changeait pas mais dans l'exemple vu en cours le professeur a expliqué que par exemple dans 3 échantillons (une référence, une condition 1 et une condition 2) on avait une quantité totale d'ARN égale mais une quantité d'ARNm à quantifier et d'ARN du gène standard en quantité différente. Ok, mais, comment on a introduit l'ARN standard dans l'expérience ?

Et enfin on a très rapidement (trop ) la RTq PCR avec l'utilisation du delta Ct pour faire une quantification relative. Déjà, je n'ai pas compris ce que c'était le delta Ct (huhuhu) et encore une fois à quoi servent les gènes de ménage ici ?

Voilà voilà... Merci d'avance pour vos réponses,

Cordialement,

une élève un peu dépassée par le cours
-----

[invite7363dc32]

Bonjour,

Alors un gène de ménage est un gène exprimé constitutivement, c'est à dire en permanence comme par exemple l'actine ou la GAPDH. L'expression de ce gène te servira de point de comparaison.
Pour comprendre les Ct je te conseille ce site : https://www.institutcochin.fr/core_f...de-la-PCRq.pdf
Lorsque tu auras compris le Ct tu verras que le delta Ct est logique : C'est la différence entre le Ct du gène que tu veux analyser et le Ct du gène "rapporteur" ou gène de ménage. Ainsi tu peux avoir une valeur relative d'expression de ton gène d'intérêt. En fait ton gène de ménage sert à normaliser tes valeurs pour pouvoir comparer différents échantillons.
Pour ton exercice :
dans 3 échantillons (une référence, une condition 1 et une condition 2) on avait une quantité totale d'ARN égale mais une quantité d'ARNm à quantifier et d'ARN du gène standard en quantité différente. Ok, mais, comment on a introduit l'ARN standard dans l'expérience ?

Tu peux par exemple en utilisant un nanodrop connaitre la quantité d'ARN que tu as dans ton échantillon. Si tu t'intéresses à un ARN en particulier par exemple la transcription du facteur de croissance TGFB par rapport à différent stimuli tu auras une quantité de cet ARN qui sera différentes en fonction de ton échantillon 1 et 2. Ce que tu vas donc faire c'est faire une qPCR pour quantifier le TGFB et un gène de ménage (ex : GAPDH) dans chaque échantillon. Ensuite tu vas faire le delta CT entre la Ct du TGFB et celle de la GAPDH. Etant donné que tu as la même quantité totale d'ARN dans tes échantillons la Ct de la GAPDH ne devrait pas beaucoup changer (puisque c'est ton gène de référence) par contre celle du TGFB oui. En rapportant une valeur à l'autre tu auras l'expression relative de ta quantité de TGFB. Je pense que ton prof à entendu par gène standard le gène à étudier.

Ce n'est pas facile à expliquer par écrit, si tu as d'autres questions suite à ma réponse, n'hésite pas !

[Fraggle Rock]

Bonjour,

je crois qu'il y a des spécialistes de la qPCR sur le forum, donc, à voir pour plus de précision. Sur le principe, quand tu fais une (RT-)PCR, tu sais que la quantité d'ADN augmente avec le nombre de cycles, suivant une courbe en S, avec une phase exponentielle au milieu. A quel moment, c'est à dire à quel cycle démarre la phase exponentielle ? Cela dépend de la quantité initiale de matrice. Et c'est bien sûr ce que tu veux déterminer par rapport à un contrôle interne.
Le Ct(gène d'intérêt) est donc le cycle où commence la phase exponentielle pour ton gène d'intérêt. Le Ct(contrôle) est le cycle où commence la phase exponentielle pour un gène de référence(dans le même tissu !), le fameux gène de ménage dont l'expression ne varie (quasiment) pas. Donc si tu calcules la différence, le Delta Ct = Ct(gène d'intérêt) - Ct(contrôle), ça te donne une estimation de la quantité relative de cDNA (donc de transcrit) de ton gène d'intérêt par rapport au gène de référence.

Donc, le gène de référence, c'est un gène de ménage, c'est à dire un gène qui est connu pour être indispensable à la survie de toute cellule et qui est exprimé de façon équivalente dans toutes les cellules et toutes les situations (en tout cas le plus possible, attentions aux biais).

Ensuite, tu peux comparer ton Delta CT entre plusieurs tissus différents (ou bien plusieurs conditions ...) et ainsi mettre en évidence des variations dans l'expression de ton gène d'intérêt, toujours par rapport au gène de référence, qui théoriquement ne doit pas bouger.

[invite9dc7b526]

Un "gène de ménage" c'est un gène qui est exprimé dans toutes les cellules, parce que la protéine joue un rôle essentiel à la vie de la cellule. Du coup ce gène est soumis à sélection purifiante (les mutations sont éliminées) et on le retrouve dans de nombreux organismes. Un exemple est le gène 18s qui se retrouve chez tous les eucaryotes, ou le 16s qu'on trouve dans les bactéries et les mitochondries. Ces gènes sont utilisés pour les programmes de "barcoding" (identification d'organismes).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitefccca761]

Merci beaucoup pour vos réponses ! C'est vraiment beaucoup plus clair pour moi avec vos explications super détaillées.
Et merci pour le site Styllisis ça m'a beaucoup aidé à comprendre.

Si jamais je bloque à nouveau je sais où me présenter

[invite3475a5d8]

Bonjour à tous, J'ai une question: Peut on déterminer l'expression relative d'un gène cible en faisant simplement Ct gène cible/Ct gène de ménage?
Surtout lorsque nous n'avons pas d'échantillon standard.