qrt PCR : gène de référence avec 2 Tm

[Guillaume69]

Bonjour,

La semaine dernière j'ai lancé une expérience préliminaire de qrtPCR (SYBR green, matrice : 10ng de cDNA issus de deux tissus différents) pour tester mes primers.

Aucun problème pour mes Cp et Tm pour mes gènes cibles (duplicates identiques)

Par contre, j'ai clairement un problème pour mon gène de référence.

Echantillon        Cp              Tm1          Tm2
E15,5 LB2	   15,74	   84.01	88.53
E15,5 LB2	   15,88	   89.13
E15,5 LB2	   15,52	   84.72
Day 6 # 1	   15,28	   88.55
Day 6 # 1	   14,97	   84.39	88.12

J'ai clairement deux Tm (un à 84 et l'autre à 89) donc deux produits d'amplification ; et j'amplifie soit l'un, soit l'autre, soit les deux.
Par contre, mon Cp ne semblent pas affecté (15 ou 16).
Pourquoi ?

Merci de votre aide...
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[Flyingbike]

comment est calculé ce TM ? Tu as la courbe de fusion ? C'est peut être un artéfact.

[Guillaume69]

Le Tm est calculé par le progamme, en obtenant le ou les maximum de la dérivée de la fonction de la courbe de fusion (= le ou les points d'inflexion de la courbe de fusion).

Et ça correspond bien à ce que j'observe sur mes courbes :
* Sur la dérivée : deux pics (un grand, un plus petit) lorsque j'ai deux Tm, un seul grand pic lorsque je n'ai qu'un Tm
* Sur la courbe de fusion : une chutte nette de fluorescence lorsque j'ai un seul pic (un point d'inflexion) et deux sauts moins nets lorsque j'ai deux Tm (deux points d'inflexions).

Donc non, je ne pense pas que ce soit un artefact dû au mode de calcul.

[Flyingbike]

Ok, si tu as la confirmation visuelle. Je demandais parce que si tu demande de calculer 47 pics de fusion, il en trouvera 47.
Sur ton tableau quelle est la différence entre les échantillons ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Guillaume69]

Les deux échantillons sont deux tissus différents à deux stades de développements différents (Limb Bud E15.5 et peau jour 6).

Au sein d'un même échantillon, il n'y a aucune différence : ce sont des réplicats techniques provenant du même master mix. Seul mon pipetage a pu varier.

Pour info, voici les autres données de Cp, j'ai à peu près les mêmes variations (certes, c'est difficile à dire avec seulement deux valeurs ; m'enfin pas d'aberration ...)

Les "Target 1, 2, ..." correspondent à mes différents gènes cibles.

Target 1
E15,5 LB2	25,3
E15,5 LB2	24,68
Day 6 # 1	21,85
Day 6 # 1	22,34

b-actin
No Template	30,1
No Template	28,59

Target 2
E15,5 LB2	24,52
E15,5 LB2	23,48
Day 6 # 1	24,46
Day 6 # 1	24,33

Target 3
E15,5 LB2	30,63
E15,5 LB2	28,41
Day 6 # 1	27,67
Day 6 # 1	27,91

Target 4
E15,5 LB2	15,45
E15,5 LB2	17,66
Day 6 # 1	15,62
Day 6 # 1	15,8

Target 5
E15,5 LB2	29,61
E15,5 LB2	28,93
Day 6 # 1	30,58
Day 6 # 1	30,79

Target 6
E15,5 LB2	21,88
E15,5 LB2	21,51
Day 6 # 1	20,44
Day 6 # 1	20,73

b-actin
E15,5 LB2	15,74
E15,5 LB2	15,88
Day 6 # 1	15,28
Day 6 # 1	14,97
E15,5 LB2	15,52

Edit : merci beaucoup de prendre de ton temps pour te pencher sur mon problème !

[kamor]

Es tu sur qu'il ne peut pas y avoir des phénomènes d'épissage alternatif ?
Cela pourrait expliquer des ARNm de longueurs différentes.

[Flyingbike]

pas dans le meme échantillon passé avec le même mix.
C'est quoi comme gène ?

[Guillaume69]

Pardon, c'est la β-actine, je pensais l'avoir précisé.

Je pense que je vais tout simplement changer de gène de référence. J'ai demandé autour de moi, c'est pas la première fois que ça arrive au labo, ainsi que dans d'autres.
Et ça le fait aussi pour GAPDH, parfois... Mais personne n'a d'explication (la biomol, c'est pas la grande spécialité de la maison).

Concernant la taille, j'aurais peut-être dû lancer un gel. Mais pour moi ça paraissait évident que deux Tm différents sur le même mix de cDNA = deux produits d'amplification différents, donc le gel ne m'aurait rien apporté.
Mais pourquoi ils ne sont pas amplifiés de la même façon au sein de la même plaque ... Aucune idée
Un mauvais pipetage lors de l'ajout de mes primers (provenant d'un même mastermix également) ? Si c'était le cas, il devrait y avoir un lien entre Tm et Cp ; là je n'en vois aucun :/

[Flyingbike]

C'est quand même pas normal. Tu dois être dans des conditions limites qui font que des fois ça le fait, des fois pas. En augmentant la T° de un demi ou un degré, ça ne résoudrai pas le problème ?

[Guillaume69]

Normalement c'est fait pour marcher à 60°C... De même que tous les autres primers fonctionnent à cette température.

Si j'augmente, je risque de faire merdouiller tout le monde, non ?

La commande du nouveau primer est partie aujourd'hui de toute façon, on va bien voir ce que ça donne, ...
J'espère que ça résoudra définitivement mon problème, sinon je monterait la température selon tes conseils

Au fait : pourquoi augmenter, et pas diminuer ? Et pourquoi ce serait la température le problème ?

[kamor]

Si tu augmentes, tu diminues normalement le risque d'amplification aspécifique.

[Flyingbike]

C'était l'idée.

Sinon, une chose que j'ai apprise, il ne faut pas faire confiance aux acquis des labos, surtout en terme d'amorces. On a des fois de belles surprises en blastant des amorces utilisées depuis des années. Tu peux déjà vérifier si il y a un risque de non spé.

[kamor]

Il ne faut pas oublier non plus que les algorithmes évoluent, ce qui peut expliquer ces surprises. J'en ai fait l'amère expérience : une version de mon logiciel m'a défini des amorces, 6 mois et 2 nouvelles versions plus tard, je pouvais jeter mes amorces ! (ce qui était confirmé par les manips).

De plus les températures sont aussi définies pour une concentration de MgCl2. Si celle ci est différente, ce qui arrive si tu utilises des kits tout faits, la température sera légérement différente. Inférieure en diminuant la concentration, supérieure en l'augmentant.

[Guillaume69]

Merci beaucoup !!

[Guillaume69]

Au fait : on peut savoir comment la concentration de MgCl2 que le logiciel prend en compte ?

Question plus théorique : pourquoi l'augmentation de la température d'hybridation diminue le risque d'amplification aspécifique (désolé, je ne suis pas à la page en biomol ...) ?
Je pensais justement que deux brins d'ADN s'hybridaient plus facilement à température élevée ...

[kamor]

Pour le MgCl2 je ne sais pas, ça dépend. Je peux te répondre pour celui que j'utilise (Beacon Designer), car la [MgCL2] peut être modifiée, mais pour les autres...

En fait, si ta température est "trop basse", tes amorces peuvent se fixer sur des sites même si l'homologie n'est pas parfaite.
La température d'annealing est normalement un peu en dessous du Tm des primers, car normalement seules des séquences très appariées pourraient rester en dimères. Par prolongement du raisonnement, plus tu diminues ta température, plus tu renforces les "liaisons" de tes amorces sur ta cible, mais il se peut aussi que celles ci se fixent ailleurs.
Plus ta température est optimale, plus tes amorces ne pourront se fixer que sur un site totalement complémentaire.

[Guillaume69]

Hello,

Nouveaux primers commandés (HPRT1), exactement la même PCR de réalisée.
Résultats :

Pos	Name	        Tm1
A5	E15,5 LB2	88.85
A6	E15,5 LB2	88.81
A7	Day 6 # 1	88.87
A8	Day 6 # 1	88.79
B5	E15,5 LB2	88.93
B6	E15,5 LB2	88.93
B7	Day 6 # 1	88.93
B8	Day 6 # 1	88.93

Pos	Name	        Cp	
A5	E15,5 LB2	26,97	
A6	E15,5 LB2	29,09	
A7	Day 6 # 1	26,88	
A8	Day 6 # 1	26,01	
B5	E15,5 LB2       26,63	
B6	E15,5 LB2	26,96	
B7	Day 6 # 1	24,56	
B8	Day 6 # 1	24,45

Satisfaisant, non ?

[Edelweiss68]

Y a pas photo !