qRT-PCR

[stonpz38]

Bonjour,
Dans le but d'étudier le taux transcriptionnel de différents gènes d'intérets, je voulais réaliser des qRT-PCR.

J'ai extrait l'ARN total puis dosé par spectro. Mon problème est à l'étape de la RT. Mes concentrations sont d'environs 30µg/mL (dans un volume de 30µL d'eau). Sur tous les protocoles que j'ai pu voir, les RT sont effectués à partir de 1µg d'ARN dans un volume final de 20µL, je n'ai pas de tels quantité.
Je voulais donc savoir si je pouvais réaliser des RT sur 300 voir 250 ng d'ARN tout en conservant les différents réactifs à bonne concentration (donc dans un volume final de 20µL).

Faites-vous un dosage spectro de vos ADNc avant la PCRq afin de déterminer la quantité à utiliser?
J'ai vu que certain ne dosait pas leurs ADNc avant PCRq. Ils diluaient le mix de RT avec de l'eau et en utilisaient un certain volume pour la PCRq. Comment déterminer à ce moment là la quantité d'ADNc utilisée? Est-ce-que 1µg d'ARN donne 1 µg d'ADNc lors de la RT.

J'espère que j'ai été assez clair dans mes questions.

Merci
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[stonpz38]

Personne ne peu m'aider?

[malesore]

Moi je suis descendu à un 10 ng/ul dans 10 ul donc 100 ng d'ARN total et ca marche très bien avec le Kit cDNA synthesis de Biorad *

Après moi non plus je ne quantifie pas mes ANDc je fais ma RT en meme temps pour tous mes échnatillons pour qu'ils soient traités de la meme facon et apres j'estime que la RT a été efficace de la meme facon pour tous et je ne résonne plus qu'en quantité d'ARN, bien sur la RT n'est pas efficace à 100 % mais on fait comme

[stonpz38]

Merci de ton aide.

[A voir en vidéo sur Futura]