Urgent: préparer gamme pr qRT-PCR

[invite50cb7a9c]

Bonjour,

Je veux faire une qRT-PCR, pour tester mes primers que j'utilise pour la 1ère fois, on m'a dit qu'il faut que je réalise une gamme de mes cDNA. Ma collègue partait d'un échantillon à 2,1 µg d'ARN total, après la RT elle commence par diluer les cDNA au 1/4 puis au 1/10, 1/50, 1/100, 1/150...
Mon échantillon est moins concentré en ARN ~0,6 µg (échantillons rares), donc je me dis que je devrais le diluer au 1/2 puis faire ma gamme, est-ce suffisant? j'ai besoin de vos conseils car comme je l'ai dit les échantillons sont rares et je voudrais pas rater cette manip,

Merci d'avance
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[invite6d6b7805]

Salut,
Deja sais tu si ton gène est assez fortement exprimé, et d'où proviennent tes ARN, ça aidera à savoir jusqu'où on peut descendre pour les limites de la gamme.
Sinon prendre 300 ng d'ARN pour une RT et q PCR c'est pas mal, remarque je dis ça car je bosse sur beaucoup moins (LMD oblige ).
J'avais testé mes primers avec une gamme de 100/50/25/12.5 ng de RNA retro transcrit dans un volume total de 20µL (kit superscript III, INvitrogen) Ouis j'en avais utilisé 1 µL pour faire ma qPCR.
Ca avait bien marché.