RT-qrt-PCR : courbe de fusion et autres contrôles

[Guillaume69]

Bonsoir,

Dans un TD, les quantités de différents ARNm sont comparées par RT-qrt PCR par incorporation de SYBR green.
Entre autres contrôles, on réalise une courbe de fusion (ou tracé de la dérivée de F=f(T), F intensité de fluo et T température).

Comment explique t-on l'allure de la courbe de fusion : faible décroissance pour T<Tm puis brusque diminution de l'intensité à Tm ?

A quoi sert de vérifier le Tm de l'échantillon ? Une chute massive signifie un Tm "unique" donc un seul produit d'amplification ?

On me dit également que cela permet de vérifier qu'il n'y a pas eu de formation de dimères de primers. S'il y en avait eu, quelle allure aurait la courbe de fusion ?
Qu'est-ce que cela changerait qu'il y en ait eu : une plus faible probabilité de fixation des amorces sur l'ADN à amplifier, donc une diminution de la vitesse d'amplification, donc une mauvaise estimation de la quantité d'ADN initiale ?

Une autre question : pour un même ARNm d'intérêt, il me semble que l'on fait des qrtPCR sur un échantillon non dilué après RT et sur des échantillons dilués.
Dans quel but ? "Juste" réaliser plusieurs mesures à partir d'une même extraction d'ARN, ou alors c'est vraiment la variation du facteur de dilution qui importe ?


Une dernière : si on avait disposé de différentes sondes taqman, aurait-on pu toutes les mélanger dans un même mix de qrtPCR ?
Je sais que ça peut se faire avec deux sondes différentes, mais jusqu'à combien peut-on aller ?


Cordialement,
Guillaume
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[kamor]

Pour ce genre de questions, je préfère t'aider à trouver la réponse que te l'a donnée direct, c'est plus intéressant pour toi.
Un seule info : la diminution continue du Sybr Green est due à une diminution de sa fluorescence avec la température.
Maintenant pour ce qui se passe à Tm, qu'est ce que le Tm et comment fonctionne le Sybr Green ? Donc pourquoi on observe ça ?

Par ta deuxième question, tu réponds à la première, oui c'est ça.

Qu'est ce qu'un dimère d'amorces ? Si tu as répondu aux premières questions, qu'est ce qui se passerait avec un dimère d'amorces.

Là si tu connais le principe de la PCR temps réel tu peux y répondre.

Dilués ou non, il faut que tu répondes à la question d'avant.

Pour le nombre de sondes, ça dépend de ton appareil. En gros, on prend des sondes qui émettent dans des différentes longueurs d'onde qui se ne gènent pas. Mais il faut que ton appareil puisse lire différentes longueurs d'onde en même temps
L'appareil avec lequel je fais joujou permet jusqu'à 5 sondes en même temps. je ne sais pas s'il y a plus

[Flyingbike]

Une dernière : si on avait disposé de différentes sondes taqman, aurait-on pu toutes les mélanger dans un même mix de qrtPCR ?
Je sais que ça peut se faire avec deux sondes différentes, mais jusqu'à combien peut-on aller ?


Cordialement,
Guillaume

Tu comprendras que pour utiliser plusieurs sondes, il faut pouvoir les distinguer. On est donc limités par le pouvoir de détection de l'appareil (nombre de canaux sélectifs d'une longueur d'onde d'émission du fluorophore).

[Guillaume69]

Bonsoir,

Merci pour vos réponses !

Un seule info : la diminution continue du Sybr Green est due à une diminution de sa fluorescence avec la température.
Maintenant pour ce qui se passe à Tm, qu'est ce que le Tm et comment fonctionne le Sybr Green ? Donc pourquoi on observe ça ?


Par ta deuxième question, tu réponds à la première, oui c'est ça.

Le Tm est la température de dénaturation ; le Sybr green étant un agent intercalant, la dénaturation le fait "sortir" de l'ADN et il n'émet plus de fluo => décroissance de F.
Plus rigoureusement, pourquoi le Sybr green n'émet plus ? (Je n'ai jamais eu aucun cours sur le fonctionnement des agents intercalants)

Qu'est ce qu'un dimère d'amorces ? Si tu as répondu aux premières questions, qu'est ce qui se passerait avec un dimère d'amorces

.
On aurait une émission de fluorescence dû à l'intercalation de sybr green "dans" les duplexes d'amorces ; ce duplexe étant caractérisé par un Tm, on aurait deux pics de décroissance de l'intensité de fluo.

Là si tu connais le principe de la PCR temps réel tu peux y répondre.

Le principe, c'est que la vitesse d'amplification du produit (en phase expo) varie dans le même sens que la quantité d'ADNc présent dans l'échantillon ; en quoi cela m'indique quel est le problème des dimères de primers et le rôle des différentes dilutions ?

Ok pour ma dernière question
Je me doutais qu'il fallait que l'appareil puisse les détecter toute. Mais je me demandais s'il valait mieux tout mettre dans le même mix (et peut-être risquer d'avoir plus de dimères d'amorces ?) ou faire plusieurs réactions.

[A voir en vidéo sur Futura]

[kamor]

Ah effectivement si tu connais pas le principe de fonctionnement du Sybr Green, ça va être plus compliqué . Pour faire simple, le Sybr Green n'émet de fluorescence que s'il se trouve dans un double brin d'ADN (quoique, peut être d'ARN je ne sais pas).
Qu'est ce qui se passe à la température de dénaturation ? Quel rapport ça a avec le Sybr Green ?

Le principe, c'est que la vitesse d'amplification du produit (en phase expo) varie dans le même sens que la quantité d'ADNc présent dans l'échantillon ; en quoi cela m'indique quel est le problème des dimères de primers et le rôle des différentes dilutions ?

La vitesse d'amplification est la même quelque soit la quantité d'ADN au départ.
La "seule" chose qui changera, c'est le nombre de cycles nécessaires pour arriver dans cette phase exponentielle.

Et maintenant la question qui t'aidera, quel peuvent être les facteurs pouvant affecter ce nombre de cycles (à part bien sur la quantité d'ADN initiale).

En fait pour les sondes, plus on met de sondes, plus ça demande des conditions spécifiques et de travail en aval pour que ça fonctionne. Dans l'absolu, c'est mieux, en pratique...

[Edelweiss68]

Bonsoir,

Pour faire simple, le Sybr Green n'émet de fluorescence que s'il se trouve dans un double brin d'ADN (quoique, peut être d'ARN je ne sais pas).

Si on se fie à wiki, "Le SYBR green I est une molécule pouvant se fixer sur tous les types d’acides nucléique double brins et devenant alors un très bon fluorophore."

[Flyingbike]

pour les primer dimers : diminution de l'efficacité de PCR donc du pouvoir quantitatif de la chose !

pour les différentes dilutions : chaque échantillon est testé a plusieurs concentrations ?

[Guillaume69]

Ah effectivement si tu connais pas le principe de fonctionnement du Sybr Green, ça va être plus compliqué . Pour faire simple, le Sybr Green n'émet de fluorescence que s'il se trouve dans un double brin d'ADN (quoique, peut être d'ARN je ne sais pas).
Qu'est ce qui se passe à la température de dénaturation ? Quel rapport ça a avec le Sybr Green ?

Donc c'est ce que je disais (chute de fluo à Tm due à la dénaturation) dans mon précédent message, non ?

Et maintenant la question qui t'aidera, quel peuvent être les facteurs pouvant affecter ce nombre de cycles (à part bien sur la quantité d'ADN initiale).

La température ?
=> Malheureusement non, ça ne m'aide pas

[kamor]

Oui et non. Effectivement la température peut jouer mais normalement la température t'est donné par des amorces et ta Taq, jouer dessus a peu d'intérêt à mon avis.
Bon en fait, ce qui peut jouer c'est tes concentrations en amorces, Taq, et accessoirement dNTP et les temps des différentes étapes.
En fait il s'agit à ce niveau plus d'un problème de statistiques que d'autre chose. Si tu n'as pas beaucoup d'amorces ou de Taq, il se peut que certains amplicons ou ADN ne s'apparient pas avec les amorces. On peut remédier ce problème en augmentant le temps mais tu augmentes le risque d'appariement aspécifique.
A l'inverse si tu en mets trop, ça peut freiner la réaction.

[Guillaume69]

Ok
Mais quel est le rapport avec les dilutions ? Comparer des échantillons différemment dilués permettrait de "voir" si l'amplification dépend bien uniquement de la concentration d'ADNc initiale et non d'un "manque de chance statistique" lié aux raisons que tu viens d'énoncer ?