Bonjour,
Je dois faire une RT-PCR en temps réel et j'ai quelques questions. Au départ, je dois déterminer l'efficacité de mes primers en réalisant une gamme de dilution de mes cDNA pour chaque primer. Une fois l'efficacité déterminée, est ce qu'il me suffit d'utiliser cette valeur pour toutes les prochaines manips sans avoir à refaire de gammes ou la gamme est obligatoire pour la quantification? j'avoue que je suis perdue
Merci d'avance pour votre aide,
Bonjour,
Il y a deux écoles...
Je suis du genre à refaire la gamme à chaque run car en général j'ai de la place...
Après si vous avez un grand nombre d'échantillons à passer pour un gène donné il est admis de faire une gamme, d'en déterminer l'efficacité et d'utiliser un des points de gamme comme standard.
En gros vous choissisez un point, vous l'aliquotez en un grand nombre de tubes que vous mettez à -80°C de préférence. Ensuite pour chaque run vous décongelez un des tubes et vous le déposez comme standard. Il doit ressortir exactement au même ct que précédemment (jour ou vous avez fait la gamme). Si c'est le cas, vous pouvez estimer que votre efficacité est identique.
Bonne journée!
Ca permet de plus d'avoir de multiples témoins positifs, chose inévitable dans un run PCR.
Et la plupart des logiciels d'analyse de runs peuvent déterminer avec une gamme dans la plaque directement les quantités (ou concentrations, ou éq génomes, ...) dans chacun de vos puits d'échantillon. Ca peut représenter un petit gain de temps assez appréciable au fil du temps si vous faisez ensuite cette PCR en routine
bonjour,
pour ma part, j'ai toujours remis une gamme dans ma plaque de PCR.
Ok merci pour vos réponse, vu que je travaille sur des échantillons rares, je pense que je vais privilégier la 2ème méthode même si c'est pas l'idéal...
Dans mon labo on fait la gamme d'efficacité une seule fois (en duplica) : si c'est OK on ne le refait pas. Quand on a un doute on refait l'efficacité mais en tout cas on ne la refait pas à chaque run!!!
Moi je sais que j'aime bien refaire l'efficacité quand c'est pas moi qui l'ai faite mais je ne la fait qu'une fois!
Merci pour la précision, j'en prends noteEnvoyé par smelly
