Urgent Clonage

[invite643e4f0b]

Bonjour,

Je viens d'arriver en post-doc où je dois faire de la bio mol alors que je n'en ai jamais fait (toujours bossé sur des cultures primaires).

J'ai la carte d'un nouveau plasmide et je dois y faire un clonage, je ne sais pas par où commencer:

J'utilise sérial cloner, j'ai identifié les sites de restriction, mais je ne sais pas comment m'y prendre, comment choisir des oligos, introduire des sites de restriction ... ETC bref je suis Out -->

toute aide, documentation détaillée etc seraient les bienvenues

Merci par avance,
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[Flyingbike]

ben.... commencez par donner le but. Cloner quoi ? qui vient d'ou ? quel vecteur ?

[invite643e4f0b]

Nous avons reçu un nouveau plasmide, je dois y faire exprimer une protéine. L'insert d'interet est exprimé dans un autre plasmide.
Je dois concevoir donc, d'après ce que j'ai compris, de nouveaux oligos pour pouvoir placer l'insert de l'ancien plasmine dans le nouveau et c'est là que je suis perdue...

[Flyingbike]

il faut donc en gros
1/ trouver les sites de restriction dans le vecteur qui serviront à insérer l'insert
2/ délimiter le gène d'intérêt dans l'ancien vecteur et dessiner des amorces permettant de l'amplifier totalement
3/ ajouter sur les amorces des sites de restriction correpondant à ce qui a été déterminé en 1/
4/ PCR
5/ digestion de la PCR d'une part et du vecteur d'autre part
6/ ligation
7/ transformation
8/ prière
9/ controles des clones

C'est pas détaillé mais il manque encore des infos : nature/taille de l'insert ? y a-t-il des sites de restriction pour le sortir de l'ancien vecteur ? faut-il cloner en phase avec quelque chose (Tag, protéine de fusion)
y a-t-il un MCS ou un truc du genre dans le nouveau vecteur ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite643e4f0b]

Merci beaucoup cela m aide deja a comprendre. A vrai dire c est precisement le design des amorces qui me pose probleme donc j ai 2 questions plus precises
1. Comment choisir les enzymes de restrictions pour ne pas decaler le cadre de lecture?

2. Les amorces doivent couvrir combien d acides aminés de l insert ? Doivent ils contenir uniquement une partie de l insert et un site de restricrestriction??


Merci infiniment

[Flyingbike]

1 le choix des enzymes ne change pas le cadre de lecture. ca dépend de ce qu'il y a en amont et en aval de votre insert, et de la longueur des amorces

2 de nucléotides ? (acides aminés = protéine...), autour de 20, plus la partie qui contient le site de restriction, plus quelques uns pour permettre la bonne digestion par l'enzyme. une trentaine en tout

[invite643e4f0b]

Super merci!

La protéine que je veux exprimer doit avoir une GFP et un tag His, ces deux là sont déjà dans le nouveau plasmide, mai puisque je dois synthetiser mes amorces avec un codon stop, comment ces tags peuvent-ils etre lus??

Merci par avance

[Flyingbike]

si y'a un codon stop dans l'amorce reverse, tout ce qui sera en aval ne s'exprimera pas. Mais le tag et la GFP ne sont pas en 5' ? ce qui serait logique. Dans ce cas il faudrait juste faire attention que l'amorce forward conserve bien le cadre de lecture


quel est le plasmide receveur ??

[invite643e4f0b]

Le vecteur est : pET28a-sfGFP-mcs-his
Justement mes sites de restriction sont entre la GFP et le His qui est en C-ter

[Flyingbike]

il ne faut donc pas de codon stop dans l'amorce