Pureté de l'ADN

[invite0fc62be3]

Bonjour à vous tous! j aurais besoin d'un coup de main svp: voilà j'ai fait une extraction d'ADN en utilisant la méthode phenol:chlorophorme:isoamyl. En voulant vérifier la pureté de mon ADN par la spectro la do a 260 n'excède pas 0.5 et le rapport 260/280 me donne 1.08 idem pour le rapport 260/230 qui est en dessous de 2 ceci laisse à croire que mon ADN est contaminé par du phenol que dois je faire pour optimiser mon protocole ? Aussi j Ai voulu utiliser de l'eau nuclease free comme blanc le problème c'est qu'elle affiche une DO de 0.4 à 260 est ce normal ? Merci à vous
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[Flyingbike]

une DO de 0,4 à 260 mais avec un blanc réalisé avec quoi ?


Quel est votre protocole actuel ? Faites vous un chloroforme seul avant de précipiter ?

[invite0fc62be3]

Re, le blanc= eau distillée autoclavé et sans nucleases. C est la.même eau dans laquelle mon ADN est en suspension pour le chlorophorme je n'en rajoute pas seul avant le précipitation de l'ADN si c'est votre question ... Eclairez moi svp

[Flyingbike]

0.40 entre deux eaux ce n'est pas normal. à controler et à résoudre, en attendant je ne me fierais pas à vos dosages spectro.


J'imagine que vous faites une extraction au phénol/chloroforme, que vous récupérez la phase supérieure, et que vous précipitez l'ADN ensuite

Classiquement, après la première extraction au phénol/chloroforme, on refait une extraction au chloroforme seul. Ca permet d'enlever une eventuelle trace de phénol

Il s'agit de récupérer la phase aqueuse dans un tube propre, d'ajouter 1 volume de chloroforme, vortex, centri, et on récupère la phase aqueuse pour précipiter. Juste une étape supplémentaire.

PS : en fonction de l'utilisation de l'ADN en question, ce genre de ratio peut être ou ne pas être un problème... Il n'est pas toujours nécessaire de rechercher la perfection.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0fc62be3]

Re, J ai refais mon extraction J ai même refais l'étape chlorophorm phenol 2fois et J ai changé d'eau distillée au final pour mesurer la do . Cette fois ci j'ai 0.07 pour la do de l'eau mais la do de mon échantillon d'ADN reste toujours faible 0.2 à 260 :'( :'( :'( petite précision j extrait mon ADN à partir de pièce tumorale fixée dans du formol pensez vous que je l'élimine pas assez ? Je fais des lavages à leau physiologique et des centri ...help je désespère