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pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante



  1. #1
    nchimix

    Unhappy pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Bonjour aidez moi svp

    j'ai pas eu de formation en biologie alors j'ai besoin de l'aide

    on cherche a savoir si une plante est muté ou non, donc possède ou non un gène nommé X par exemple

    j'ai un couple d'amorce X:LP/RP et LB/RP
    mon probleme est justement ce couple d'amorce sens & antisens

    sur le gel on a trois possibilité :

    LP/RP positif LB/RP négaf : plante non muté ?
    LP/RP positif LB/RP positif : plante muté qui a les gene Aa
    LP/RP négatif LB/RP positif : plante muté, qui a que ce gene X:aa

    qu'est ce qui s'est passé ? qu'est ce que c'est LP/RP et LB/RP

    j'ai trouvé sur internet " brassage intrachrosomique " est ce qu'il y a un lien ?

    je crois que je comprends vraiment rien a ce que je fais

    merci d'avance

    -----


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  3. #2
    dalmia

    Re : pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Bonjour nchimix,

    Je ne sais pas du tout ce que tu maîtrises ou non dans ton exercice, alors j'essaie d'aborder les différents points à comprendre pour te guider.

    1. Pour commencer, comprends tu bien ce qu'est la PCR, et ce que sont les amorces dans ce contexte ?

    2. Alors apparemment le test vise à déterminer, pour un gène donné qui s'appelle "A", si ta plante est homozygote AA, hétérozygote Aa ou homozygote aa.
    Explications si besoin : Nous possédons tous nos gènes en deux exemplaires (un qui vient de la mère, un du père) qui peuvent être les mêmes (on est alors "homozygote" pour ce gène - exemple très discutable pour illustrer : deux fois le gène "yeux verts"), ou alors on a reçu des versions différentes de chacun de nos parents pour ce gène (on est alors "hétérozygote". Dans l'exemple : un gène "yeux marrons", un gène "yeux verts). Est-ce que ça va ça déjà ? Revenons aux plantes

    3. Dans ton exercice, on considère deux versions pour le même gène : A et a. "A" est la version non mutée, et "a" la version mutée (pour comprendre le sens de l'exo on s'en fiche un peu, toujours est-il que ces deux gènes n'ont pas exactement la même séquence). Ce qui implique que ta plante peut être soit AA (elle a deux fois la version "A" du gène en question), Aa (un de chaque) ou aa (deux fois la version "a"). OK ? Pour le savoir, on fait cette PCR.
    Je m'arrête là dans mon blabla et te propose ce schéma qui illustre les trois possibilités de génotype pour ta plante et ce qu'il se passe pour chacune selon les amorces. Tu me dis si tout ça prend du sens ?

    nchimix.jpg

    Dalmia

    PS : je précise que les amorces dessinées en losange/carré/rond c'est de la vulgarisation pour montrer un genre de puzzle, en vrai on va parler d'hybridation/appariement entre les nucléotides des amorces et ceux de l'ADN de la plante.
    Dernière modification par dalmia ; 15/03/2018 à 05h22.

  4. #3
    nchimix

    Re : pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Bonjour

    Merci merci merci beaucoup pour votre réponse tout est déjà plus claire.

    Je fais un stage en bio ( je sais pas pk je me suis lancée la dedans ), je travail sur une plante. on cherche plusieurs gène.

    mon nouveau problème c'est le couple d'amorce LB/RP ; ou peut être les deux ..

    on dit que le couple LP/RP c'est l'amorce pour la plante normal ( comme vous l'avez très bien expliqué )
    et LB/RP l'amorce " muteé" cad que ce couple va reconnaître le gène muté dans l'adn ( c bien ca ?)

    alors pourquoi on n'obtient pas de signal de LP/RP sur un gel pour une plante "aa" car apres une extraction d' ADN ; dans le tube j'ai toute l'adn de la plante cad j'ai les séquences que vont tricoter les LP/RP et aussi les séquences pour LB/RP.

    et dernièrement q'est ce que c'est T-DNA, j'ai trouvé sur le net que le LB et RP s’insère sur les extrémité de ce T-ADN .. donc c'est lui le gene muté ? ou il contient le gène muté ?

    est ce que vous pouvez me conseiller des livres ou des articles sur ce sujet ?

  5. #4
    dalmia

    Re : pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Coucou,

    Est-ce que cette vidéo t'aide ? : https://www.youtube.com/watch?v=QBcxFwp3Byo

    Les amorces sont des bouts d'ADN fabriqués artificiellement avec une certaine séquence que l'on choisit. Pour une PCR donnée, on utilise deux amorces, une pour délimiter le "début" de la région d'ADN échantillon à étudier, et l'autre pour marquer la "fin". Tu choisis la séquence de chacun de tes amorces pour viser la séquence d'intérêt (en respectant A avec T, et G avec C).

    Il faut comprendre qu'une PCR peut avoir de multiples applications. Grossièrement, on peut avoir deux cas :
    1. Le premier, c'est que la PCR n'est pas une fin en soit. Tu l'utilises comme outil, car tu as besoin d'une grande quantité d'ADN. Il y aura d'autres étapes ensuite à ta manip.
    2. Le deuxième, c'est notre cas ici. En fait, tu t'en fiches d'amplifier, tu veux analyser ton échantillon grâce à la PCR, selon si elle a bien donné lieu à une amplification ou pas.

    Dans ton exo, il y a 3 amorces :
    _ RP (le rectangle noir dans mon dessin) : s'apparie que le gène soit A ou a. Elle sert à marquer la "fin", en gros, de la séquence amplifiée.
    _ LP : (losange rouge) spécifique du gène A. Si cette amorce se retrouve avec le gène a, elle ne peut pas s'apparier et il n'y aura donc pas d'amplification.
    _ LB : (rond gris) spécifique du gène a. Utilisée avec RP, tu peux amplifier que le gène a. Et pas le A, dont la séquence ne permet pas son appariement.

    On obtient "pas de signal de LP/RP sur un gel pour une plante "aa"" car l'amorce LP ne s'accroche pas à a mais à A.


    Le T-DNA, c'est de l'ADN contenu dans un plasmide. Ce n'est pas de l'ADN génomique "normal", c'est de l'ADN supplémentaire, de forme circulaire. A l'origine, cet ADN est la marque d'une plante qui a été infectée et qui est malade. On se sert actuellement de ce plasmide comme outil en biologie moléculaire : tu peux venir modifier les propriétés d'une plante en lui ajoutant un gène par exemple, qui sera porté par ce plasmide.
    Il semblerait que ton gène A ou a, chez tes plantes, est porté par ce type de plasmide et non dans son ADN original. On est dans un contexte de transgenèse dans ton exo ?

    Dalmia
    Dernière modification par dalmia ; 16/03/2018 à 11h25.

  6. #5
    nchimix

    Re : pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Bonjour et encore merci beaucoup

    mais je comprend pas le fait que LP/RP ne peut pas se lier a l'ADN " normal "
    c le couple d'amorce qui reconnait l'adn normal alors que LB lui il reconnait que le gène muté.
    dans le micro tube il y a beaucoup d'adn dont les parties muté.
    ce que je veux dire ; ce n'est pas tout l'ADN qui est muté, donc sur ces partie non muté le couple LP/RP ( sens anti sens) devrait se coller alors que ce n'est pas le cas
    c'est comme si on avait fait l’amplification de que la partie qui possède le gène muté puisque sur l'électrophorèse on obtient un signal pour LB/LP et donc homozygote (négatif pour LP/RP)

    j'y arrive pas a expliquer ce qui me torture la tette avec ce LP/RP.

    29387096_10156428812749170_6360949013230911488_n (1).jpg

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    dalmia

    Re : pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Bonjour,

    Alors je crois que tu t'es emmêlé les pinceaux, tu viens de dire "je comprend pas le fait que LP/RP ne peut pas se lier a l'ADN "normal" " alors que justement, tu nous as présenté ce couple d'amorces comme celui qui peut se fixer et donc permettre l'amplification du gène normal. Oublie RP qui est l'amorce qui se fixe dans les deux cas.

    La différence entre ton gène normal et ton gène muté est justement la portion de gène qui est fixée par LP ou LB. Si c'est le gène normal, seul LP peut se fixer car la séquence nucléotidique ne permet pas à LB de se fixer (c'est ce que je t'ai dessiné avec une forme donnée pour chaque amorce de façon à présenter ça sous la métaphore d'un puzzle). Si le gène est muté, une portion du gène est donc différente. Cette différence entraîne la non fixation de LP et l fixation de LB. Non, tout l'ADN n'est pas muté effectivement.

    Je suis désolée mais j'ai vraiment l'impression de tourner en rond dans mes explications, sans comprendre ce que tu ne comprends pas =/

    Bon allez je tente un dernier truc, simplifié au possible pour essayer de concrétiser ça. On laisse toujours RP de côté, lui il s'hybride dans tous les cas, je détaille pour LP et LB.
    Imagine que le début de ton gène à amplifier est cette séquence : AAAAA...
    Alors que le début du gène muté c'est : AAGAA ... Un A a été remplacé par un G, voilà la mutation.
    _ Tu choisis une amorce pour qu'elle vienne se fixer au gène normal, tu vas choisir TTTTT pour que ces 5 T s'hybrident aux 5 A. Cette séquence (=LP) ne peut pas s'hybrider sur la séquence mutée puisque T ne s'apparie pas avec G.
    _ Tu choisis une amorce pour qu'elle vienne se fixer au gène muté, tu vas choisir TTCTT pour que les T se lient aux A et que le C se lie au G. Tu me suis ? Cette séquence (=LB) ne peut se lier qu'à une partie mutée et pas la partie normale.

    Dalmia

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  10. #7
    nchimix

    Re : pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Bonjour

    excusez-moi pour le retard, je voulais pas écrire avant d’etre sur de comprendre. je pense que je me suis mal exprimée et je crois que j'ai trouvé qq chose.
    mon problème etait le couple d'amorce, vous avez peut etre expliqué mais je comprenais pas
    pour moi ce couple d'amorce dit " normal" pouvait s’insérer partout.

    LP/RP est le couple d'amorce "spécifique" à un gène et LB/LP reconnait ce gène spécifique mais muté.
    un gène A par exemple
    ce gene de la plante est muté ( grâce a une bactérie qui transfère T-ADN ). ce T-DNA vient dans ce gène qu'on s'intéresse A-(T-DNA)-A' = appelé mutation gene A a était modifier = a

    LB/LP reconnait cette mutation
    LP/RP reconnait donc le gène non muté
    LB/RP les gène muté

    d'ou les résultats
    LP/RP positif LB/RP negatif plante non muté AA pas de TDNA
    LP/RP positif LB/RP positif plane Aa => A gene normal et a gene muté
    LP/RP negatif LB/RP positif plante aa

    je ne sais pas si je suis entrain de dire des bêtises ou répéter la même chose que vous avez écris et je dois encore chercher lol
    Dernière modification par nchimix ; 06/04/2018 à 22h33.

  11. #8
    dalmia

    Re : pcr : LP/RP et LB/RP pour une plante

    Bonsoir,

    Citation Envoyé par nchimix Voir le message
    pour moi ce couple d'amorce dit " normal" pouvait s’insérer partout.
    Eh bien non, comme je le dis et répète dans mes pavés...

    Je crois que tu viens de répéter ce que je t'ai expliqué trois fois déjà
    J'ai l'impression que tu as compris, mais le top serait que tu en sois convaincu/e toi aussi !

    Courage
    Dalmia

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