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Screening avec librairie d'ARNg + cas9



  1. #1
    Klownerz

    Screening avec librairie d'ARNg + cas9


    ------

    Bonjour ! Je suis en train d'étudier un article scientifique que j'ai pioché sur Pubmed et je rencontre quelques difficultés à saisir la méthodologie, je m'explique :

    On réalise une expérience de screening. Des clones de cellules cancéreuses ont été modifiés pour exprimer Cas9, on transfecte ensuite dans ces mêmes cellules une librarie d'ARNguide dans un vector lentivirus. On sélectionne ces cellules cancéreuses avec soit des Lymphocytes T qui attaquent spécifiquement ces cellules cancéreuses (Ltx) soit des Lymphocytes T non spécifique (contrôle (Ltc)).

    On fait ensuite un séquencage du génome des cellules cancéreuses survivantes pour voir si certains ARNg seraient plus ou moins présents que d'autres afin d'en déduire l'importance de certains gènes dans la résistance ou la sensibilité à la destruction des lymphocytes T spécifiques des tumeurs.

    Je ne comprends pas la manip qui consiste à transfecter une bibliothèque d'ARNg : ne risquons nous pas d'avoir un Knock-out de tout le génome ?? Et même si seulements quelques ARNg s'intégraient, le fait d'avoir d'avoir plusieurs KO par cellule modifierait profondément son fonctionnement non ? (L'association de plusieurs KO particuliers pouvant avoir des conséquences que les KO pris séparemment n'auraient pas...)

    Merci pour votre aide, a plus =)

    -----
    Dernière modification par Klownerz ; 09/08/2018 à 15h27.

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  3. #2
    TanguyE

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    Bonjour,

    Pourrais tu partager le lien vers le papier? Parce que (sans vouloir te vexer) la description de la méthode que tu proposes est un peu confuse.

  4. #3
    Klownerz

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    Alors j'ai accès au document via les ID de ma fac, je peux pas le partager visiblement. A moins de te c/c toute l'experience je vois pas comment faire pour rendre ca moins confus, que trouves-tu confus? On y arrivera peut etre comme ca!

  5. #4
    TanguyE

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    Si tu mets le lien pubmed de la publi ça ira, j'ai également des ID d'accès.

    En fait c'est le passage sur la transfection des ARN, je penses qu'il y a un truc pas très clair dans ce que tu présentes et je soupçonne une erreur de compréhension/traduction.

  6. #5
    Klownerz

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9


  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    TanguyE

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    Alors c'est un plus complexe que ce que je pensais, je me suis renseigné sur la méthode du coup parce que j'avais du mal à comprendre...

    Si tu veux, je te conseille de lire cette page sur les pooled libraries : https://www.addgene.org/pooled-library/library-guide/
    .

    En gros l'idée c'est que tout se fait dans un seul tube, le seul truc pour que ce soit valide c'est de s'assurer d'avoir 400 cellules par gRNA pour faire en sorte que statistiquement 1 seul gRNA soit transduit par cellule. Ensuite il s'agit de mesurer l'enrichissement ou la déplétion de certains gRNA dans la population de cellules, synonyme de résistance ou de sensibilité respectivement.

    Du coup dans le cas de KO multiples en général sur ce genre de screens c'est éliminé dans les screens secondaires.

    J'espère que ça t'aide un peu. (En fait j'ai compris le truc mais je suis pas sur de bien l'expliquer )

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  10. #7
    Klownerz

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    Donc quand on dit dans mon article qu'on transduit une librairie d'ARNg dans les cellules c'est que potentiellement chaque cellule pourrait recevoir un ARNg apparenant a la librairie, mais on sous entend que dans tous les cas qu'un seul ARNg sera effectivement (statistiquement) transduit. C'est pour cela qu'il faut avoir bcp plus de cellules que de vecteurs pour s'assurer qu'il n'y est en moyenne qu'une seule incorporation et donc qu'un seul KO par cellule ? Ai-je bien compris ce que tu voulais dire?

    Merci de ton aide et du temps que tu y as visiblement consacré
    Dernière modification par Klownerz ; 09/08/2018 à 23h31.

  11. #8
    TanguyE

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    C'est bien ça en effet.

    Merci de ton aide et du temps que tu y as visiblement consacré
    De rien.

  12. #9
    Klownerz

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    Ah et une dernière chose en rapport toujours avoir le sujet, serais-tu également capable de me dire ce que deviens l'ARNg transduit dans le cas d'un screening? J'ai cherché plusieurs heures (sans rire) y compris dans le lien que tu m'avais donné sans trouver l'information :

    - Est-il incorporé au génome après une reverse-transcription ?
    - Sinon, comment fait-on pour le détecter par la suite par Illumina séquencing ?

  13. #10
    TanguyE

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    En fait ce n'est pas l'ARNg qui est directement transduit mais un lentivirus contenant une cassette d'expression de cet ARNg. Les lentivirus étant des rétrovirus, la cassette d'expression de l'ARNg sera incorporé au génome de la cellule ce qui permettra la production de cet ARNg. C'est cette dernière qui détectée par séquençage.

  14. #11
    Klownerz

    Re : Screening avec librairie d'ARNg + cas9

    Merci beaucoup =)

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