Question : analyser une protéine

[Seiter2468]

Bonjour j'aurais une série de questions

Supposons que l'on connait le nom d'une protéine dans un organisme et que l'on veut identifier la structure primaire pour déterminer quel gène la code.

Comment et avec quel protocole et matériel peut on concrètement faire ça ?

Je connais l’électrophorèse qui permet de différentier des protéines en fonction de leur masse et la spectrométrie de masse qui permet d'identifier les acides aminés présents.

Mais ma question principale est la suivante

Comment isoler une protéine voulu ? Identifier ensuite sa séquence en acide aminé ? Et enfin identifier la séquence de paire de base qui la code ?

Merci pour votre attention !
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[Pterygoidien]

Disclaimer : Ce sujet dépasse le cadre de ma formation et une meilleure réponse proviendra surement de quelqu'un qui poursuit ses études (ou les a entamées) en biochimie. Je vais tout de même tenter de donner une réponse sur base de ce qui m'a été enseigné dans mes cours de biochimie. J'espère que ça sera satisfaisant.

Attention qu'analyser la séquence primaire d'une protéine ne permet pas nécessairement d'en déduire sa séquence nucléotidique correspondante : l'expression des gènes va impliquer d'une part un épissage et une maturation de transcrits ARN, mais également, pour chaque peptide correspond un jeu de codons ARN quelque peu différents. Un gène peut donner plusieurs protéines différentes grâce à un processus d'épissage alternatif. De même, une protéine peut compter plusieurs sous-unités chacune codées par un gène différent. Le collagène par exemple possède 3 sous-unités, et chaque sous-unité peut appartenir à l'un des 13 gènes codant pour le collagène : il existe ainsi de nombreuses combinaisons différentes qui peuvent donner de très nombreux types de collagène (dans les faits, on en observe seulement 28 chez l'homme).

Pour ce qui est d'analyser la séquence peptidique (structure primaire) des protéines, il y a plusieurs étapes. D'une part, il faut séparer les solutions et mélanges qui contiennent plusieurs protéines, et les purifier. La séparation de ces protéines peut s'obtenir de plusieurs façons, en fonction du poids moléculaire, de la taille, de la distribution de charges, et d'autres propriétés physico-chimiques qui vont moduler la migration de ces protéines et peuvent également varier selon les paramètres de ton milieu (pH, température, tonicité, etc...) dans un milieu. La centrifugation, par exemple, permet de fragmenter un extrait en fractions en fonction de leur poids. Une autre méthode qui est plus couramment employée est la chromatographie sur colonne. Ces principes sont bien expliqués dans les manuels de biochimie (Biochimie de Voet chez de boeck, Lehninger Biochemistry, Harper, etc.). Cette dernière méthode va trier les protéines sur base de leur taille, leur poids et l'affinité de liaison grâce à la présence d'un milieu poreux sélectif. Il existe également d'autres méthodes de chromatographie qui vont s'intéresser à différentes propriétés, dont la chromatographie à échange d'ions, etc...

Quand tu as extrait et purifié la protéine dont tu souhaites déterminer la séquence, il faut préférablement la dénaturer, notamment lyser les éventuels ponts disulfure au cas où il y en aurait : on utilise le réactif de Cleland (DTT), qui est un réducteur porteur d'un thiol (sulfurhydryl) qui va se fixer aux résidus portant les mêmes groupes thiol (la cystéine en l'occurence), ou accessoirement le 2-mercaptoéthanol. Tu peux ensuite procéder au séquençage, par plusieurs méthodes.
Historiquement, la première méthode a été faite avec l'insulin par F. Sanger : il est à noter, qu'à l'heure actuelle, cette méthode (la méthode Sanger) est peu employée. Cette méthode est l'inverse de la méthode d'Edman : le principe repose sur le fait de modifier le peptide terminal de ta séquence et de l'analyser, et de refaire à chaque fois le cycle. Ici,on va faire réagir le peptide purifié avec un réactif, le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (FDNB), ou du chlorure de dansyl. Ce réactif va se fixer sur la terminaison N-terminal : on hydrolyse ensuite le peptide sous milieu acide, ce qui va décomposer le peptide en acides aminés, plus le dernier acide aminé modifié (et labelé par le FDNB). On sépare les différents acides aminés en fonction de leur propriétés et on analyse le peptide modifié (par chromatographie, par exemple).

Il y a la méthode d'Edman : cette méthode fait intervenir un cycle de deux étapes. On fait réagir ton peptide avec un réactif, le phénylisothiocyanate (PITC) dans un milieu alcalin. Ce réactif va venir se fixer sur l'extrémité de ton peptide et réagir avec l'acide aminé N-terminal, et va modifier ce dernier en un dérivé phénylthiocarbamyl (carbamylation). On change ensuite le pH en conditions acides, ce qui a pour effet de cliver le résidu N-terminal du reste du peptide (qui lui, reste intact) : on isole alors le dérivé et on l'analyse pour en déduire le type d'acide aminé. On isole le peptide raccourci d'un acide aminé et on refait le cycle : c'est le processus d'Edman.


Source : Lehninger Biochemistry

La méthode d'Edman est plus pratique que la méthode de Sanger (du point de vue du nombre d'étapes, et parce que le peptide reste intact, on peut le réutiliser pour les cycles suivants).

On peut utiliser également la spectrométrie de masse pour déterminer la séquence, je pense que c'est la méthode la plus employée à l'heure actuelle, mais n'étant pas formé en biochimie, j'ai peur de m'aventurer plus loin sur ce terrain. La spectrométrie de masse est un sujet plus complexe à aborder.

[minushabens]

Supposons que l'on connait le nom d'une protéine dans un organisme et que l'on veut identifier la structure primaire pour déterminer quel gène la code.

si tu connais le nom de la protéine, il faut commencer par chercher dans l'une des bases de données publiques, comme RCSB PDB : https://www.rcsb.org/

[Pterygoidien]

si tu connais le nom de la protéine, il faut commencer par chercher dans l'une des bases de données publiques, comme RCSB PDB : https://www.rcsb.org/

Insert surprised Pikachu meme

[A voir en vidéo sur Futura]

[Seiter2468]

Bonjour à tous les deux et merci de vos réponses !

Oui pour ce qui est de savoir le nom d'une protéine je ne voulais pas vraiment dire cela haha.
à vrais dire j'ai posté une autre question sur le forum où je demandais comment analyser une protéine responsable d'une réaction dans un anabolisme (bon il n'y a pas encore eu de réponses haha). Du-coup après avoir analysé cette protéine je voulais le cheminement pour déterminer quel séquence d'ADN la codait. Mais merci pour ces réponses d'une grande clartés !