demande d'aide sur la PCR HRM

[invite61328f94]

Bonjour tout le monde,

je viens de m'inscrire sur ce forum, qui semble très intéressant pour résoudre les problèmes et donner des avis des gens du domaine,

je suis étudiante en thèse, et je travaille sur le développement et l'optimisation technique PCR HRM pour l'identification d'un parasite sur des échantillons de terrain. et ceci en utilisant le l’instrument LightCycler 480 et son logiciel pour l'analyse de mes résultats.

d’après la littérature j'ai choisi un couple d'amorces spécifique à mon ADN, j'ai testé ce couple d'amorces sur des ADNs pure du parasite (que j'utilise en tant que ADNs de contrôles positif) avec PCR conventionnelle puis avec PCR HRM j'ai eu de très belles courbes!

mais , malheureusement quand je teste mes primers sur l'ADN de l'animal réservoir, je trouve des courbes oui (celà veut dire que l'animal est infecté et qu'il y'a eu une amplification), mais Tellement que les valeurs des Cps sont trés élevés (>35-40) que le logiciel les prends par défaut comme des négatifs!!

aprés une dizaine de manip et sachant que j'ai fais toutes les solutions possibles qui ont été recommandées dans le guide de l'utilisateur de cet appareil. je n'arrive encore pas d'optimiser mes résultats!!

qu'est ce que vous me conseillez de faire dans une telle situation??

j'ai même essayé de chercher un paramètre sur le logiciel qui peut m'aider mais vu que je ne le maîtrise pas, j'ai rien pu faire!

i really need help :'(

merci d'avance,
cordialement.
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[Flyingbike]

mais , malheureusement quand je teste mes primers sur l'ADN de l'animal réservoir, je trouve des courbes oui (celà veut dire que l'animal est infecté et qu'il y'a eu une amplification), mais Tellement que les valeurs des Cps sont trés élevés (>35-40) que le logiciel les prends par défaut comme des négatifs!!

on se comprend pas...

Cp >35-40 ? c'est peu, et c'est normal que votre logiciel le prenne comme du négatif...

En qPCR, un bon Cp est entre 10 et 30 pour faire large

[invite61328f94]

Bonsoir Monsieur,

c'est exactement mon problème, quand je teste mes amorces sur l'ADN pure des souches de Leishmania ça marche très bien mais dés que je fais une autre HRM avec ces mm amorces Avec les ADNs extraits à partir de l'animal réservoir, j'obtiens toujours des Cp qui sont très élevées, et du coup le logiciel les prends comme des négatifs :/ comme dans chauqe réaction je met tout d'abor mes ADNs controles puis en bas dans la plaque mes ADNs de réservoir, je me suis dit que peut etre que le logiciel me donnent des valeurs de Cps pour les ADNs de réservoirs par rapport à ceux des contrôles positifs, donc j'ai essayé de diluer la concentration des ADNs de ces deriners jusqu'à 1ng/µl ... ça n'a rien changé, le problème persiste

que dois je faire pour les rendre inférieures ou égales à 30 ???? et là je me pose la question ?? le problème est au niveau de la réaction elle même ? il manque quelque chose ?? ou bien il est au niveau du logiciel??? est ce qu'il y'a possibilité de changer un paramètre sur le logiciel pour qu'il ne les prend pas pour des négatifs??

merci.

[Flyingbike]

Il ne s'agit pas de forcer le système. Il faut déjà déterminer si vos signaux faibles sont des positifs où l'amplification fonctionne mal, ou si ce sont des négatifs dont vous observez du bruit de fond.


Deja, vous avez des contrôles positifs, donc visiblement la réaction fonctionne.

Quelle quantité d'ADN avez vous par réaction ? Avez vous testé en gamme ? Pour info, 1ng/µL pour de l'ADN pur c'est beaucoup. Vous pourriez diviser par 1000 et avoir toujours du signal.

[A voir en vidéo sur Futura]