Isotype en cytométrie

[jujutou]

Bonjour,

Je suis en laboratoire de recherche et j'ai un souci que je n'arrive pas à éclairer.

Je me lance dans la cytométrie en flux, et donc je m'organise dans les différents anticorps et surtout les isotypes. Mais je n'arrive pas à savoir quelle caractéristique doit avoir un isotype pour être utilisable pour l'anticorps de référence.
En effet, dans le laboratoire où je viens d'arriver, nous avons plein d'anticorps, mais pas énormément d'isotype.

Qu'est-ce qu'il faut prendre en compte ? L'espèce hôte, son fluorochrome, son clone, son IgG, .... ?

Par exemple, je veux utiliser un anticorps anti-CD62L réalisé chez le Rat et anti-Souris, avec le fluorochrome APC, un isotype IgG2 a,k et clone MEL-14
Si j'utilise un isotype fait chez le Rat, conjugué APC, mais avec un isotype IgG2 a (donc pas de k) est-ce que cela sera bon ou il faut absolument que l'isotype soit identique à l'anticorps ? (donc IgG2 a,k) ?

De même, nous avons des isotypes simplement IgG (plus un fluorochrome), cela signifie qu'il est compatible avec tous les IgG1 ou IgG2 ?

Cette partie est très flou pour moi et je n'arrive pas à trouver de réponse ...

Merci pour votre aide !
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[sansplomb]

Bonjour,

Il faut tout prendre en compte, espèce, fluorochrome, IgG2a, b etc. pour aller plus loin il faut également que l'isotype provienne du même fournisseur (protocole et qualité du couplage).
Enfin pour une bonne utilisation des isotypes, il faut utiliser la même quantité d'Ac (entre le marquage et l'isotype) en fonction du nombre de cellules.
A cause de toutes ces considérations, les isotypes sont rarement utilisés correctement et peux informatifs. Il vaut mieux se battre sur le choix des fluorochromes en fonction de votre panel et de l'expression des marqueurs.
Si vous avez des difficultés pour placer vos régions, utilisez plutôt des FMO (fluorescence minus one, il y a des papiers la dessus: Mario Roederer par exemple) et bien sur du Fc block avant marquage pour bloquer le marquage non spécifique. dernier point, titrer vos Ac est également important.

Bonne chance

Phil