Dot Blot interprétation

[invite3bb6fcda]

Bonjour à vous tous !

J'aimerais savoir comment interpréter ce DOT BLOT, merci !



Pour ce qui concerne la protéine P-AMPK, j'aurais tendance à dire qu'elle ne s'exprime pas pour les contrôles, donc sans être traité à la MT (metformine) dans les cellules hepatocytaires (WT = HepG2) mais qu'en revanche elle s'exprime dans les cellules hepatocytaires traitées à la metformine.

Cependant pourquoi ? car contrairement à l'AMPK, elle ne s'exprimée pas pendant le contrôle. Il y à un groupement phosphate en plus, En est-ce la raison ?

Et pourquoi utilise t-on l'actine ??

Notre but est d'étudier l’expression et le taux de phosphorylation de la protéine AMPK par la technique du dot blot et par la suite de définir les rôles des transporteurs OCT1 et OCT3 dans la régulation de la néoglucogenèse par la metformine (MF) dans les hépatocytes – Effets de leur invalidation sur la réponse de cellules hépatocytaires à la MF.

Nous pouvons déjà émettre l'hypothèse que l'OCT3 serait le transporteur de la protéine P-AMPK, mais pour AMPK qu'en est-il ?

Bonne journée !

Gohuuu
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[Flyingbike]

On va reprendre.

Déjà, P-AMPK est une forme phosphorylée de AMPK. On ne parle donc pas d'expression de P-AMPK puisque c'est une modification post-traductionnelle.
Dans le contrôle, la MF induit la phosphorylation de l'AMPK. Cela tombe bien car c"est comme cela que la metformine exerce son action thérapeutique.

Le dot-blot AMPK permet de s'assurer que l'expression d'AMPK est constante et que ce que l'on observe pour la P-AMPK est lié à l'augmentation de sa phosphorylation et non à une augmentation de son expression. De même l'actine est un "gène de référence" qui permet de s'assurer de l'homogénéité du dépôt.


Dans les cellules invalidées pour OCT1, la MF n'a plus d'effet sur la phosphorylation d'AMPK. Par contre l'invalidation de OCT3 n'a pas d'effet.


OCT n'est pas un transporteur de l'AMPK. L'AMPK ne se "transporte pas". Par contre c'est un transporteur de petites molécules comme la metformine.

Que pouvez vous conclure concernant le transport et l'action de la metformine sur l'AMPK ?

[invite3bb6fcda]

Bonjour Flyingbike, merci pour ta précieuse aide.

Dans le DOT BLOT A, on observe que la metformine s'exprime dans les cellules HEPG2 lorsque OCT1 et OCT3 ne sont pas invalidés.
On observe également qu'elle ne s'exprime pas lorsque OCT1 est invalidé et qu'elle s'exprime lorsque OCT3 est invalidé.

On peut donc en conclure que OCT1 est le transporteur membranaire qui permet de faire passer la metformine dans le cytoplasme afin de phosphoryler la P-AMPK afin de séquestrer le TORC2 dans le cytoplasme et de diminuer la quantité de glucose dans le sang.

Cependant pour ce qui est du B et du C, même OCT1 invalidés, le taux de phosphorylation est élevé...

Pouvait vous m'en dire plus sur le besoin d'utiliser l'actine ici ?

Merci !

[Flyingbike]

il faut reprendre les choses calmement

Je crois que vous mélangez !

Dans le DOT BLOT A, on observe que la metformine s'exprime dans les cellules HEPG2 lorsque OCT1 et OCT3 ne sont pas invalidés.
On observe également qu'elle ne s'exprime pas lorsque OCT1 est invalidé et qu'elle s'exprime lorsque OCT3 est invalidé.

la metformine est un médicament qu'on ajoute, il n'est pas question de dire si elle s'exprime ou pas. On peut dire qu'elle induit la phosphorylation de l'AMPK sauf lorsqu'on invalide OCT1

On peut donc en conclure que OCT1 est le transporteur membranaire qui permet de faire passer la metformine dans le cytoplasme afin de phosphoryler la P-AMPK afin de séquestrer le TORC2 dans le cytoplasme et de diminuer la quantité de glucose dans le sang.

Oui, mais là vous allez plus loin que la figure. En se basant uniquement sur la figure, on ne peut dire que cela : OCT1 est nécessaire à l'action de la metformine sur la phosphorylation de l'AMPK.

Cependant pour ce qui est du B et du C, même OCT1 invalidés, le taux de phosphorylation est élevé...

En B on regarde l'AMPK totale, et pas la phosphorylation
En C on regarde l'actine, pas d'histoire de phosphorylation.

Ces deux panneaux (B et C) permettent de dire que l'effet de la metformine, absent si on invalide OCT1, n'est lié qu'a une modification de la Phosphorylation et non pas à une modification de la quantité d'AMPK (a taux de phosphorylation constant, si on avait eu PLUS d'AMPK totale on aurait pu aussi avoir plus de phospho-AMPK, cela permet de dire que ce n'est pas le cas)

Pouvait vous m'en dire plus sur le besoin d'utiliser l'actine ici ?

Comme dit juste au dessus, l'actine permet de voir que l'on a une quantité de protéines totales a chaque dépôt. Et que donc les variations d'expression ou de phosphorylation ne sont pas liées à des différences de dépôt, ou de quantification des protéines lors de l'expérience.
Pour cela il faut considérer que l'expression de l'actine dans les cellules est CONSTANTE.


C'est bon pour vous ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3bb6fcda]

Certes les panneaux B et C permettent donc de dire que l'effet de la metformine n'est lié qu'a une modification de la phosphorylation et non à une modification de la quantité d'AMPK mais je ne comprends pas alors pourquoi lorsque OCT1 est invalidé, le panneau B montre tout de même une phosphorylation élevée ?

Je ne pense pas comprendre le but du panneau B, que montre le contrôle ? (il ne peut pas mettre en évidence la phosphorylation de l'AMPK puisque c'est le but du test MF juste en dessous ?)

[invite3bb6fcda]

Les contrôles permettent de mettre en évidence l'expression de l'AMPK et P-AMPK dans les cellules HEPG2 et sont indépendants de l'invalidation de OCT1 et OCT3 ?

[Flyingbike]

Certes les panneaux B et C permettent donc de dire que l'effet de la metformine n'est lié qu'a une modification de la phosphorylation et non à une modification de la quantité d'AMPK mais je ne comprends pas alors pourquoi lorsque OCT1 est invalidé, le panneau B montre tout de même une phosphorylation élevée ?

Le panneau B ne montre pas de phosphorylation, il montre AMPK totale

Je ne pense pas comprendre le but du panneau B, que montre le contrôle ? (il ne peut pas mettre en évidence la phosphorylation de l'AMPK puisque c'est le but du test MF juste en dessous ?)

il montre que le traitement ou l'invalidation des OCT ne modifient PAS la quantité d'AMPK totale, et que du coup ce qu'on observe en A est bien lié à la phosphorylation

Les contrôles permettent de mettre en évidence l'expression de l'AMPK et P-AMPK dans les cellules HEPG2 et sont indépendants de l'invalidation de OCT1 et OCT3 ?

Oui. On aurait pu, en absence de OCT1 ou OCT3, avoir une absence de phosphorylation de AMPK, mais qui serait due au fait que l'invalidation provoque une baisse de l'expression de l'AMPK. Ce n'est pas le cas donc on peut dire que l'effet de l'invalidation touche la modification post-traductionnelle !

[invite3bb6fcda]

Merci beaucoup Flyingbike !
Tu m'as bien éclairé sur les résultats de ce DOT BLOT et de la manière dont on le lit.

Si j'ai d'autres questions sur ce sujet, je reviendrais répondre ici.

Je te souhaite une agréable journée.

Gohuuu

[Flyingbike]

avec plaisir

bonne journée!

[invite3bb6fcda]

Bonjour !

Je reviens sur ce sujet pour en savoir plus sur la metformine (MF).

La MF est utilisé comme médicament et son action thérapeutique est de faire diminuer la concentration de glucose dans le sang en diminuant la néoglucogenèse.

La MF est apporté dans le cytoplasme par le transporteur OCT1 et va phosphoryler l'AMPK pour qu'à son tour, la P-AMPK phosphoryle le TORC2.

Or avant que le TORC2 ne soit dans le cytoplasme, il était dans le noyau.

Est ce que c'est grâce au fait que la MF est été déplacée dans le cytoplasme que le TORC2 se soit déplacé jusque dans le cytoplasme ?
Genre que ce soit l'un des effets de la MF ? Effet attracteur ?

Bonne journée.

Gohuuu

[Flyingbike]

Non, pas d'effet attracteur.

Vous avez un résumé fait par d'anciens collègues ici :

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3398862/

voyez du coté de la figure 2.


Sachez que le mécanisme d'action de la metformine a été élucidé bien après qu'on ait commencé à l'utiliser comme médicament. L'hypothèse selon laquelle P-AMPK phosphoryle TORC2 et du coup l'empêche d'aller dans le noyau est visiblement remise en question. Le sujet est complexe !