Immunofluorescence

[Gohuuu]

Bonjour tout le monde !

Une petite question pour mieux comprendre l'immunofluorescence !

Je voulais savoir pourquoi faut-il privilégié l'immuno détection indirect à l'immuno détection direct pour mettre en évidence la protéine TORC2 par immunofluorescence ?

Sachant que l'on sait que l'immuno détection indirect possède davantage de site de fixation grâce aux anticorps primaire ce qui permet d'obtenir une intensité lumineuse plus importante et donc acquérir une plus grande précision.

Nous savons aussi qu'un traitement par la metformine provoque la sortie de la protéine TORC2 du noyau.

Je voulais donc savoir ce que l'immuno détection indirect a de plus que l'immuno détection direct, ou ce qu'il diffère entre les deux techniques ?

Je sais également qu'il existe une immuno détection indirect par WESTERN BLOT ou DOT BLOT, qu'est ce qui diffère entre cette technique et l'immuno détection indirect par immunofluorescence ?

Je vous souhaite une agréable journée !

Cordialement,

Gohuuu
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[TanguyE]

Bonjour,

L'emploi de l'immunofluorescence indirecte est privilégiée en règle générale pour des raisons de coûts et de facilité en plus de l'amplification du signal fluorescent dont tu parles. L'IF directe nécessite de modifier les Ac primaires avec un fluorophore, ce qui peut revenir très cher si tu fais beaucoup d'IF avec beaucoup de cibles différentes. Par exemple, si tu fais 10 manips avec 10 cibles différentes, il faut modifier les 10 Ac primaires avec un fluorophore pour faire de l'IF directe. Admettons maintenant que tes 10 Ac primaires soient tous des IgG de souris. Si tu choisis de faire de l'IF indirecte, tu auras toujours besoin de tes 10 Ac primaires mais tu peux utiliser le même Ac secondaire anti-IgG de souris marqué par un fluorophore pour tes 10 manips.

Pour ce qui est de la différence entre IF et WB/Dot Blot, c'est le même principe de détection d'une protéine donnée dans un échantillon, la différence réside dans le type d'échantillon. L'IF se fait sur un tissu ou des cellules immobilisés sur une lame alors que le WB ou le Dot blot se font sur un échantillon liquide (lysat cellulaire ou tissulaire, milieu de culture...). L'IF permet de répondre à la question "où se trouve ma protéine dans mes cellules ou mon tissu?" alors que le WB/DB répond à la question "est-ce que ma protéine est présente dans mon échantillon?"

[Gohuuu]

Merci pour ta réponse TanguyE,

Ici j'essaie d'étudier la distribution subcellulaire du co-activateur TORC2 par la technique d’immunofluorescence.

D'ailleurs je ne comprends pas forcement bien le terme "distribution subcellulaire".

Pourrais-tu m'éclairer ?

[TanguyE]

La distribution subcellulaire, c'est la distribution à l'intérieur de la cellule. Ce que tu cherches c'est de savoir où, dans la cellule, ta protéine est localisée: noyau, réticulum endoplasmique, golgi, mitochondrie, membrane...

[A voir en vidéo sur Futura]

[Gohuuu]

Merci TanguyE !

Je reviendrais sur ce TOPIC si j'ai d'autres questions

Je te souhaite une agréable journée !

Gohuuu

[Gohuuu]

UPDATE:

Comme dit précédemment, l'IF et le WESTERN BLOT ou DOT BLOT permettent d'apporter des informations sur la localisation d'une protéine dont la différence réside dans l'apport de l'information.

Cependant qu'elles sont les avantages à utiliser de préférence l'IF au WESTERNBLOT, DOTBLOT et vis versa ?

[Flyingbike]

le Dot blot est de moins en moins utilisé. il apporte moins d'informations que le WB car il n'y a pas de séparation des protéines selon leur PM.
L'IF est peu quantitative (contrairement au WB) mais apporte des indications structurales (contrairement au WB) puisqu'on visualise la cible in situ