efficacité de la stérilisation par cocote minute pour la culture de champignons

[pmassonnat]

Bonjour,

j’essaie de faire une culture de champignon en injectant une seringue de mycélium dans un pot de confiture qui contient des graines de blé bio stérilisé 90minutes dans une cocote minute.

Malheureusement, j'ai toujours la même moisissure verte qui apparaît sur mes graines Elle semble partir de partout en même temps come si elle était déjà présente à la base dans les graines. Pourtant, je les met dans leurs pot fermé dans une cocotte minute pendant 90minutes.

Du coup je me demande si c'est la stérilisation dans la cocote minute qu marche pas?

Merci de vos conseilles.


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[Flyingbike]

En combien de temps apparaît la moisissure verte ?
Êtes vous sur de la stérilité de l’inoculum ?

Les spores résistent très très bien à la chaleur. Pourquoi ne pas stériliser pots ouverts et les fermer dès la fin du cycle ? La vapeur devrait tout tuer

[pmassonnat]

Ca marcherai mieux si je les m’ettais ouvert? Bah ce qui m’embête c'est que dès que je vais rouvrir la cocote minute, les germes vont entrer dans les pot et le deuxième problème c'est que les céréale risque de se gorger encore plus d'eau, mais ca c'est peut être pas un vrais problème...

Merci pour ce conseil, ca se tente...

Je ne sais pas en combien de temps apparaissent les moisissure exactement, je dirai en un peu moins d'une semaine.

[RomVi]

Bonjour

As tu fais un essai avec un bocal et un couvercle intact, qui reste fermé ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[pmassonnat]

ah salut

oui, je pense que oui. Mais je ne peux pas en être sûre.

En tout cas le couvercle à 'air de bien fermé et les bocaux sont sans fissures.

[RomVi]

Il est possible que la température ne monte pas suffisamment haut à cœur car les graines agissent un peu comme un isolant. Pour limiter la quantité d'eau apportée par la vapeur il faut chauffer en 2 fois : Une 1ere avec le couvercle, et une seconde fois en le retirant (les graines seront déjà chaudes donc la vapeur ne s'y condensera que très peu).

[Flyingbike]

Bonne idée de RomVi

Pour répondre à votre interrogation du #3 : le couvercle doit être ouvert mais posé sur le pot. En fermant le pot dès l’ouverture de la cocotte il n’y a aucun risque de contamination.

Pour revenir à votre protocole de stérilisation, 90 minutes à la cocotte c’est quand même assez long ! La soupape laisse bien échapper de la vapeur ?

[pmassonnat]

oui, la soupape laisse échapper de la vapeur, je commence à compter à ce moment là. Selon le tutoriel que j'ai suivi, on le met 90min au lieu des 30min dans un autoclave car la température monte moins haut dans une cocote minute... (110°C environ).

Je comprend pour l'idée du chauffage en 2 fois et pour les couvercles, merci, c'est un bon tuyau, je vais tenter ca pour la prochaine fournée. Mais la vapeur va t elle vraimant rentrer avec les couvercles posées?

[Flyingbike]

Un cycle d’autoclave standard c’est 15 minutes à 121, sous 1 bar. Et microbiologiquement je vous garantis que tout est mort.
Pas de problèmes pour les couvercles posés, mais juste une question : que mettez vous dans les bocaux, du blé cru ? Avec de l’eau ?

Vous n’avez pas répondu à ma question plus haut : êtes vous sur de la stérilité de l’inoculum utilisé ?

[RomVi]

Je me suis amusé à faire une petite expérience : J'ai placé un petit bocal de riz dans un autocuiseur électrique, et j'ai mesuré la température dans la cocotte et au cœur du bocal.
Comme je ne pouvais pas mettre le poids, pour passer les fils des sondes, la température est limitée à 100°C. L'eau a même fini par s'évaporer, heureusement mon cuiseur est équipé d'une fonction de limitation de température.

On peut voir que la température à cœur met un bon moment à monter, et le bocal ne fait que 350 ml.

[pmassonnat]

Un cycle d’autoclave standard c’est 15 minutes à 121, sous 1 bar. Et microbiologiquement je vous garantis que tout est mort.
Pas de problèmes pour les couvercles posés, mais juste une question : que mettez vous dans les bocaux, du blé cru ? Avec de l’eau ?

Vous n’avez pas répondu à ma question plus haut : êtes vous sur de la stérilité de l’inoculum utilisé ?

Je prépare le blé. Je le rince pus le fait tremper dans de l'eau avec du CaCo3 pendant une nuit puis je le fait bouillir pendant 10 minute avant de l'égouter.

L'inoculum est un produt que j'ai achetté sur ebay, donc je ne peux être sure de rien. Mais peut être inossement je pense que les gens qui font ca savent ce qu'ils font (contrairement à moi qui débute lol).

Cela dit, pour les prochains essais (il faut d'abord que je finisse mes confitures, je garde les pot contaminé pour voir comment ca évolut), je vais surement les laisser une semaine sans rien inoculé pour voir. Après tout ca pourait aussi venir des manipes que je fais lors de l'inoculation même si ca n'en a pas l'air...

[pmassonnat]

Je me suis amusé à faire une petite expérience : J'ai placé un petit bocal de riz dans un autocuiseur électrique, et j'ai mesuré la température dans la cocotte et au cœur du bocal.
Comme je ne pouvais pas mettre le poids, pour passer les fils des sondes, la température est limitée à 100°C. L'eau a même fini par s'évaporer, heureusement mon cuiseur est équipé d'une fonction de limitation de température.

On peut voir que la température à cœur met un bon moment à monter, et le bocal ne fait que 350 ml.

Merci pour cette étude. L'unitée dans ton graphique en abcisse c'est bien des minutes?

[RomVi]

Oui c'est bien ça.

[pmassonnat]

ay ouai, ca fait quand même 10 degrés de moins, même après 90minutes de chauffe. J'avous que je suis surpris, j'imaginais qu'après 90minutes de chauffe la température serait uniforme dans l'ensemble de l'enceinte de chauffage, c'était sans compté sur l'aspect logarithmique du truc...


Mais du coup, faut il augmenter le temps de chauffe? Le préchauffage doit suffire non? Peut être aussi que 90-100°C pendant près de 90minute ca suffit pour stériliser puisque le temps est plus long...

[Flyingbike]

le fait que la cocotte soit restée ouverte a du beaucoup jouer, mais effectivement il y a une belle différence.

A l'autoclave (ou a la cocotte), le maintien de la pression + couvercle entrouvert permet la pénétration de la vapeur et donc une montée en température plus rapide et homogène.

L'idée du substrat non inoculé gardé en parallèle est une très bonne idée, au moins ça exclura un problème d'inoculum (ou pas !)

[RomVi]

Avec des bocaux ordinaires il y a de l'eau, qui est un bon conducteur (surtout par convection), et donc permet de chauffer en masse. Ici il y a des grains solides et de l'air, donc la chaleur se transmet très mal. Si on garde le couvercle juste posé sur le pot ça ne changera pas grand chose, car l'air restera piégé, il faut ouvrir le bocal pour favoriser sa diffusion, mais il faut déjà que le contenu soit chaud pour ne pas y condenser de la vapeur.

[Flyingbike]

Normalement on devrait pouvoir obtenir une stérilité avec de si petits bocaux. Au labo, on arrive bien à stériliser des pots de 1L avec des tubes ou des petits instruments, des substrats placés dans des contenants dont le bouchon est en coton, des tubulures placées dans des sachets en papier et dont les extrémités sont soigneusement emballées dans de l’aluminium.... tout est fermé ou entrouvert et ça condense un peu à l’intérieur mais ça prouve bien que de la vapeur pénètre et la stérilité est de toute façon bien la...
On ne peut évidemment pas travailler avec les contenants ouverts car la stérilité prend fin à l’ouverture de la cocotte, mais entrouvert pour que la vapeur entre. Ici, les éléments qui doivent rester secs sont passés au four à sec pour evaporer toute condensation, mais sur du blé un peu d’humidité ne devrait pas être dramatique. Artisanalement, si on travaille vite et proprement, on peut stériliser bocal ouvert avec les couvercles à côté et fermer immédiatement quand tout est encore bien chaud.
Il est vrai qu’un autoclave médical/biologique un peu moderne fonctionne un peu différemment : une phase de vide, puis injection de vapeur (qui du coup va partout), puis re phase de vide pour le séchage (dans le cas où on stérilise autre chose que des tissus)

Après tout, il y a quelques années j’avais cultivé des champignons sur seigle, dans des pots de confiture passés à la cocotte et je n’avais pas eu de problème.

[pmassonnat]

désolé de cette question hors sujet, mais est ce que le vide peut stériliser? Genre 0.5Bar çà peut faire quelque chose?

Sinon, je commence de plus en plus à me dire que ma principale erreur est de fermer systématiquement les bocaux avant de les mettre dans la cocote minute. Dans le tuto que j'ai suivit, il dit qu'il faut les emballer dans de l'aluminium pour éviter que trop d'eau rentre dedans, je pensai que c'était pour les filtres mais peut être que c'est par ce qu'il ne serre pas les couvercle sans le mentionner...

Cela étant la problématique d'avoir la bonne température dans un substrat de culture me semble un vrais problème, je réfléchit à utiliser une autre méthode comme les ultraviolet (stérilisation par l'ozone) ou le vide (si ca marche), ou qui sait pourquoi pas l'alcool? Je pourait tout imbiber d'alcool puis faire chauffer ma boite avec son filtre pour faire évaporer l'alcool et ensuite l'inoculer non? Ou encore tremper mon grain dans de la javel puis ajouter de la soude caustique pour la neutraliser, le résultat serait juste un peu saler, non? Sinon, j'ai oui dire que les spores avaient une durée de vie limitée, peut être que je peux maintenir les graine sèche dans le vase clot pendant cette durée de vie puis injecter jusqu'il faut d'eau avant de l'inoculer?

[RomVi]

Le vide ne fonctionnera pas, les UV non plus. La meilleure méthode reste la vapeur, mais il faut modifier un peu ton protocole.

[Flyingbike]

le vide ne stérilise absolument pas. D'ailleurs, on prépare des lyophilisats bactériens ou de levures par le vide, ils sont toujours vivants !

L'alcool, c'est pareil. Outre le fait que ce n'est pas pratique et que cela peut dénaturer des composants du milieu, des spores résistent très bien à l'alcool pur. Les UV, c'est passable pour une surface peu contaminée, dès qu'il ya du volume c'est strictement inutile. En plus, il faudrait des UV-C germicides qui sont dangereux.

Les spores ont une durée de vie limitée, peut être. Mais ça peut se compter en années ou en décennies.

Microbiologiquement, les deux seuls moyens de stérilisations fiables que l'on peut appliquer à votre cas sont la chaleur humide et les rayons gamma. Inutile de vous dire de ne pas essayer la seconde option.

Pour illustrer mes propos, voici quelques exemples auxquels je suis confronté dans le cadre de mon travail
Pour dénombrer des spores de certains Bacillus, on fait chauffer la préparation à 85° pendant 5 minutes pour les faire germer et détruire les bactéries non sporulées. Les spores poussent très bien après cela.
Pour "tuer" une levure, je teste plusieurs méthodes : l'immersion dans de l'éthanol absolu, ensuite évaporé, ne la tue pas. L'exposition de la levure sèche ou en solution pendant plus d'une heure à des UV à 234 nm ne la tue pas.

EDIT : croisement avec RomVi qui est d'accord avec moi. La vapeur DOIT fonctionner car c'est utilisé en routine dans TOUS les labos de recherche, microbiologie ou autre, qui nécessitent des conditions de stérilité. Il faut juste poursuivre vos tests.

[pmassonnat]

bon, donc je dévisse mes couvercles avant de les mettre dans la cocoque pour conclure et on verra bien. Si ca marche pas, j'ajouterai un préchauffage.

Merci pour votre aide et pour vos conseilles.

[pmassonnat]

Voila, je reviens aux nouvelles.

J'ai refait la stérilisation à la cocotte en enlevant bien les couvercles et j'ai sterilisé 2 fois pendant 90minutes.

J'ai aussi essayé une stérilisaton au microonde à coté parcequ'il me restait des graines et que je n'avai plus que des pots avec des couvercles en plastique (les boite 1 et 4 sur la photo).

J'ai inoculé les boites 3,4 et 5 et j'ai laissé en témoins les 1 et 2.

on a pas de mycelium sur les 1 et 2 donc j'en déduis que les deux mode de stérilisations ont fonctionné.
par contre j'ai des moisissure turquoise dans les 3 pots inoculé et leur position semble correspondre à l'endroit où j'ai injecté le mycelium de "Panellus stipticus".

Pas moyen de trouver la couleur du mycelium que j'ai injecté sur internet, du coup je me demande si la culture liquide est comptaminé ou si c'est bien le bon champignon lol.


En tout cas, merci pour votre aide.

[Flyingbike]

Super pour le retour.

On en vient bien à l'hypothèse du message #2 : l'inoculum est compromis, car vraisemblablement le mycélium de ce champignon est plutôt blanc !

[pmassonnat]

Super pour le retour.

On en vient bien à l'hypothèse du message #2 : l'inoculum est compromis, car vraisemblablement le mycélium de ce champignon est plutôt blanc !

snif, ca arrive souvent qu'une culture liquide achetté sur internet soit compromise?

[Flyingbike]

Je ne sais pas. C’est un particulier ?


Personnellement je n’ai que des souches qui viennent de l’ATCC mais l’usage n’est pas le même

[pmassonnat]

ouai c'était sur ebay...

Je vais me renseigner sur l'ATCC, merci

[calvir]

Bonjour ;

Un cycle d’autoclave standard c’est 15 minutes à 121, sous 1 bar. Et microbiologiquement je vous garantis que tout est mort.

Cela dépend beaucoup du milieu à stériliser, pour du milieu liquide ou gélosé, c'est quasiment toujours vrai (pour un volume jusqu'à 1 L), mais d'expérience, pour du sol ou du composte, même après 4 stérilisation à 121°C/30 minutes, il reste toujours des bactéries et champignons qui arrivent à pousser...

[noir_ecaille]

Il y a la tyndallisation qui consiste à stériliser en plusieurs phases alternant chaleur (mais pas trop non plus) et température plus clémente. Le bute est de faire germer les formes sporullées ou équivalent afin de les tuer, tout en préservant le milieu (c'est notamment indiquer pour stériliser des milieux fragiles/thermosensibles).

Tentez un mix en la tyndallisation et l'autoclave peut-être ?

[pmassonnat]

Il y a la tyndallisation qui consiste à stériliser en plusieurs phases alternant chaleur (mais pas trop non plus) et température plus clémente. Le bute est de faire germer les formes sporullées ou équivalent afin de les tuer, tout en préservant le milieu (c'est notamment indiquer pour stériliser des milieux fragiles/thermosensibles).

Tentez un mix en la tyndallisation et l'autoclave peut-être ?

Tu peux m'en dire plus sur la tyndallisation? wikipedia n'est as très claire

[pmassonnat]

Bonjour ;


Cela dépend beaucoup du milieu à stériliser, pour du milieu liquide ou gélosé, c'est quasiment toujours vrai (pour un volume jusqu'à 1 L), mais d'expérience, pour du sol ou du composte, même après 4 stérilisation à 121°C/30 minutes, il reste toujours des bactéries et champignons qui arrivent à pousser...

RomVi parlais de problème en lien avec la conduction thermique et 'inertie thermique, il a fait une etude experimentale plus avant de ce topic, c'est peut être pour ca.