Bonjour voici un exercice qui m'a un peu 😪 besoin d'aide s'il vous plaît..
LELONAGE(première partie)
On voudrait cloner un fragment d’ADN eucaryote dans la bactérie E.coli ; la difficulté de ce clonage réside sur le fait qu’il n’y a pas de sélection positive pour ce fragment car l’information génétique portée par cet ADN ne s’exprime pas dans une bactérie. Ce fragment n’est donc identifiable que par les sites de restriction qu’il porte.
Le vecteur plasmidique pSB119 utilisé pour ce clonage confère aux bactéries qui l’hébergent la résistance à l’ampicilline ; il porte en outre des sites uniques de restriction pour plusieurs endonucléases de restriction.
Le protocole mis en œuvre est le suivant :
Le fragment d’ADN eucaryote est digéré par BamHI cette digestion génère 8 fragments parmi lesquels le fragment à cloner. Le produit de cette digestion est mélangé au plasmide pSB119 linéarisé par ; après incubation en présence de la ligase, le mélange de ligation est utilisé pour transformer une E. coli sensible à l’ampicilline. Après 24h d’incubation des colonies bactériennes apparaissent sur la boîte de Pétri.
On analyse l’ADN plasmidique issus de 20 clones différents, tous contiennent le plasmide refermé sur lui-même.
Pour expliquer ce résultat on décide d’insérer le fragment d’ADN (voir carte) au site Pst I. Ce fragment confère aux bactéries qui l’hébergent la résistance au chloramphénicol (le gène cat sur la figure)
QUESTION I
I-1 donner les raisons qui expliquent le fait qu’un gène eucaryote ne s’exprime pas dans une cellule procaryote. Quels changements sont nécessaires sur le gène et sur le vecteur pour obtenir cette expression.
I-2 pourquoi a-t-on choisi un autre insert en gardant le même vecteur ?
I-3 décrire en quelques étapes le protocole expérimental permettant d’obtenir un clone renfermant un plasmide recombiné avec le nouvel insert.
I-4 quel est en paires de base la taille de ce plasmide ?
I-5 deux types de plasmides recombinés A et B sont attendus dans la deuxième manipulation ; ils sont digérés séparément par EcoRI ; donner le nombre et la taille en paire de bases des fragments d’ADN générés.
Avec un des plasmides A ou B on réalise le protocole suivant : digestion par HindIII, puis inactivation de l’enzyme. Les produits de la digestion sont ré circularisés par la ligase et le mélange de ligation est utilisé pour transformer des bactéries sensibles à l’ampicilline et au chloramphénicol. L’étalement est d’abord effectué sur milieu solide contenant l’ampicilline ; 100 clones sont prélevés et repiqués sur milieu contenant du chloramphénicol. Les 100 clones ampicilline résistants se répartissent en 80 clones chloramphénicol sensibles et 20 clones chloramphénicol résistants.
QUESTION Ii
II-1 pourquoi est il nécessaire d’inactiver Hind III ?
II-2 interpréter la répartition des clones obtenus
II-3 Combien de clone aurait on dû analyser pour avoir 1 contenant le fragment d’ADN eucaryote recherché ?
CLONAGE (suite)
En prenant en compte les résultats de la dernière fiche de TD on vous demande de poursuivre le clonage du fragment d’ADN eucaryote.
Pour cela on vous conseille de reproduire le protocole précédent mais en substituant EcoRI à Hind III. On vous prédit les résultats suivants :
Sur 100 clones ApR analysés il n’y en aura que 10 CmR
III-1 pourquoi la proportion de clones CmR a-t-elle changé ?
III-2 les ADN issus des 90 clones CmS sont-ils semblables ? Sinon quelles sont les proportions théoriques des diverses catégories.
Apres cette étape on vous propose le protocole suivant
Digestion par Eco RI dans des tubes séparés des plasmides A et B (confère TD1) inactivation de l’endonucléase, suivi de l’addition de la ligase. Digestion des molécules ré circularisées par MluI, transformation d’une souche ApSCmS, étalement des bactéries transformées sur milieu contenant l’ampicilline.
Vous obtenez les résultats suivant : 0 clones avec le plasmide A et plusieurs clones avec le plasmide B.
III-3 donnez sous forme de schéma l’orientation de l’insertion PstI –PstI dans pSB119 correspondant aux plasmides recombinés Aet B
III-4 Que peux t on conclure quant au devenir d’un ADN plasmidique linéarisé dans E. coli ?
Après toutes ces mises au point on vous demande de revenir au problème de départ à savoir le clonage du fragment d’ADN eucaryote. Après un examen minutieux de la carte de restriction de ce fragment on remarque la présence d’ un site unique EcoRI situé de telle façon que la portion d’ADN réellement intéressante se trouve intégralement dans un fragment BamHI-EcoRI. On vous propose alors le protocole suivant :
Double digestion BamHI et Eco RI du mélange pSB119 avec l’ADN eucaryote ; lors de cette opération le fragment de 21 pb du plasmide est perdu ; inactivation des endonucléases puis ré
circularisation des molécules obtenues par digestion avec une ligase ; transformation de bactéries ApS et étalement sur milieu contenant l’ampicilline.
On vous prédit comme résultat qu’un clone sur deux contiendra l’ADN recherché.
III-5 combien de fragments sont générés par EcoRI et BamHI sur l’ADN eucaryote ?
III- 6 Le résultat prédit est- il correct ? Pourquoi?
L’ADN eucaryote analysé comporte une autre région intéressanteentièrement contenue entre 2 sites Mlu I qu’on vous demande de cloner dans le plasmide PBR 322 (voir carte dans les notes de cours)
III-7 pourquoi est- il impossible de réaliser ce clonage en une seule étape ?
III-8 Quelle stratégie allez-vous mettre en œuvre pour arriver à cloner ce fragment ?
III-9 est- il possible de réaliser le clonage du fragment qui vous intéresse en sélectionnant des bactéries ApRCmR ? Si oui détaillez les différentes étapes du protocole
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