Des informations transmises par PCR/RT-PCR

[Glazun]

Bonjour, étudiant en médecine, je me retrouve embêté (déjà) par quelques items concernant le RT-PCR.

Contexte : dans un exercice, grosso modo, on teste l'expression de la protéine de NT5DC2 dans des échantillons tumoraux prélevés par biopsie.
L'un des items est : "la RT-PCR détecte environ entre 2 et 9 copies du gène NT5DC2 dans les tissus tumoraux". On a répondu par la négative.

Mon problème est le suivant, j'ai beaucoup de mal à comprendre le pourquoi du comment.

On nous donne 2 documents d'intérêt (concernant la RT-PCR) pour cette question.

A. Expression par RT-PCR du gène NT5DC2 dans le poumon sain (N) et les biopsies de cancer du poumon nPC(T).
D. Score d'immunomarquage de NT5DC2 réalisé sur les coupes de poumons sains (N) et de tumeurs (T).



Premièrement cette notion de copies de gène : parle-t-on de la protéine, ou de l'ARNm ?
Pour rechercher le nbre de copies du gène dans les tissus tumoraux, doit-on s'intéresser aux biopsies ou aux lignées cellulaires ? L'un concerne un vrai patient et l'autre seulement une expérience in-vitro non ?

Ensuite dans les schémas, dans le A on parle de "NT5DC2 mRNA (folds)". Qu'est ce que (folds) ? Comment interpréter cette figure qui est assez trompeuse, le nbre de "folds" étant justement compris entre 2 et 9...

Le schéma D me pose le même problème d'interprétation. Qu'est-ce que le "NT5DC2 histological scores" ...


L'item est-il invalidé parce que la RT-PCR ne peut pas détecter fondamentalement le nbre de copies d'un gène dans un tissu ? Ce qui me paraîtrait logique, moi qui croit avoir compris que la RT-PCR se base simplement sur un ARNm d'intérêt (qui représenterait donc une copie de gène) qu'on va retranscrire en ADNc et multiplier. Pas forcément de liens avec le nombre de copies du gène en question dans le tissu au départ donc ? Ces 2 docs seraient alors juste de l'enfumage ?
Ou alors je n'ai rien compris.

D'ailleurs en se basant sur cette supposition, quel document aurait-pu me permettre de déterminer ce fameux nombre de copies de gènes ? L'immunomarquage serait-il une possibilité ? Ou la cytométrie de flux ?

Voilà je m'excuse d'avance pour ce pavé. J'ai cherché sur internet les réponses à mes questions, mais visiblement elles sont trop peu claires pour le moteur de recherche...
Je vous remercie donc d'avance.
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[Flyingbike]

Bonjour

Il vous manque une notion, et vous faites une confusion.
Dans le contexte de la figure présentée, on mesure une expression. C'est à dire, à un instant t, quelle est la quantité de messagers codant NT5DC2 dans un échantillon.
C'est une mesure généralement relative, c'est ce qu'indique l'échelle du graphique qui représente un niveau d'expression relatif à la condition contrôle en "folds", en l'occurence, la condition contrôle est "1" (ou 100%), et dans le tissu tumoral c'est environ 5 fois plus.

Par "nombre de copies de gènes" on entend généralement le nombre de gènes codant une protéine dans le génome. C'est une grandeur qui n 'est pas dynamique et qui ne prédit pas la quantité de messagers ou de protéine fonctionnelle. Ce n'est pas ce qu'on analyse ici.

Pour l'analogie, ce n'est pas parce que vous avez 15 exemplaires de 20 000 lieues sous les mers et 1 exemplaire de Guerre et Paix que vous lirez plus souvent Jules Verne que Tolstoï.

Au final, le message de la figure A, c'est simplement que dans le tissu tumoral le gène NT5DC2 s'exprime plus que dans le tissu sain.


En D, il faut un peu de contexte. Mais le score histologique est une appréciation, généralement multi factorielle, d'une lésion tissulaire, en l'occurence tumorale, qui permettra en suivant une grille de lecture d'attribuer des scores à différents paramètres, dont la somme est une indication de la sévérité de la lésion. C'est une approche anatomopathologique.

N'hésitez pas à demander plus de précisions si besoin.

[Glazun]

Merci beaucoup pour cette réponse ! Effectivement c'est plus clair quand on comprend les notations.

Il me reste une incompréhension, concernant A. : j'ai du mal à relier les résultats que l'on obtient avec un PCR ou RT-PCR avec le milieu in-vivo.

Pour réaliser un RT-PCR (ici), on soustrait à notre milieu d'intérêt un ARNm (ici NT5DC2), qui découle directement de l'expression d'un gène par copie d'un fragment d'ADN, dont on retranscrit l'ADNc, que l'on amplifie ensuite sur x cycles.
X étant un nbre choisi par nos soins. On a donc théoriquement un nombre connu d'ADNc in-vitro en fin d'expériences, quel que soit l'ARNm de départ.

A moins que, justement, le processus d'amplification soit "hors de contrôle" et que la quantité d'ADNc en fin de circuit d'amplification varie en fonction de paramètres x ou y ?

Néanmoins, ce qu'on va donc obtenir, c'est un très grand nombre d' "ADNc" reliés à un même ARNm, que l'on supposera peut-être impacté par le cancer.

D'où vient donc le rapport de quantité d' "ARNm " en A. d'un milieu par rapport à l'autre, alors que la RT-PCR amplifie de l'ADNc et pas de l'ARNm.

Considère-t-on que la quantité d'ADNc à la fin des cycles est représentative de la facilité / difficulté des gènes à exprimer leurs séquences, et donc qté ADNc = qté ARNm ?

[Flyingbike]

Oui

On admet que la rétrotranscription a un rendement de 1 et est homogène. Dans ce cas, on déduit du signal de qPCR la quantité initiale d'ADNc et donc d'ARNm.

C'est une obligation technique étant donné qu'on n'a pas à disposition de système enzymatique pouvant amplifier directement de l'ARNm.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Glazun]

C'est noté. Merci beaucoup !