Viabilité qPCR

[Nosnibor]

Bonjour,
J'ai réalisé des essais de viabilité qPCR (vqPCR) avec PMA. Mes échantillons ont été analysés par qPCR et par vqPCR. Je considère que ces analyses me donnent les valeurs de cellules totales non lysées (qPCR) et de cellules viables (vqPCR). De ces valeurs, je calcule les cellules mortes perméabilisées (qPCR - vqPCR).
Pour certains échantillons, j'obtiens un résultat négatif parce que les valeurs de vqPCR > qPCR.
Si l'écart est très important entre les 2 valeurs, il faut émettre des hypothèses pour comprendre pourquoi les valeurs vqPCR > qPCR.
Mais lorsque l'écart est faible, différence non significative par rapport à la variabilité de la méthode, pour la suite je considère que le niveau des cellules mortes est nul.
Je me pose la question de cette valeur.
Est-ce que je peux mettre 0 (mon niveau de population de cellules mortes = 0) ? La différence étant nulle, je considère que l'écart qPCR- vqPCR = 0 .
Est-ce que je dois plutôt mettre la valeur de la limite de détection de la méthode ? La différence étant nulle, je considère que l'écart qPCR- vqPCR = limite de détection de la méthode.
En dessous, je ne sais pas puisque je ne peux pas détecter au-delà d'un certain seuil.
Merci pour vos réponses qui alimenteront ma réflexion.
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[Flyingbike]

comment fonctionne le PMA ? c'est un crosslinker qui n'atteint que l'ADN de cellules perméables ?


Ce qui me chagrine, c'est que par définition, le signal qPCR inclut la totalité du signal vqPCR, il est donc nécessairement supérieur, et la différence est nécessairement positive. Si ce n'est pas le cas, il faut s'interroger sur la validité de la méthode, avant de chercher à quantifier quoi que ce soit.

On est d'accord que le traitement préalable à l'extraction est la seule différence entre les deux conditions ?

[Nosnibor]

Oui, c'est bien cela :
1) le PMA n'atteint que l'ADN de cellules perméables
2) le traitement préalable à l'extraction est la seule différence entre les deux conditions

Le signal qPCR est > au signal vqPCR pour la plupart des échantillons. Cependant, pour un petit nombre d'échantillons, la valeur obtenue par qPCR est < à la valeur obtenue par vqPCR du fait de la variabilité analytique. Mais le calcul mathématiques est <0. Il faut se poser la question du sens biologique de ce calcul. Si par exemple, j'ai une valeur de qPCR de 6,1E6 unité génome/mL et une valeur de vqPCR de 6,6E6 unité génome/mL alors la valeur qPCR - vqPCR sera <0. Mais d'un point de vue biologique, étant donnée la répétabilité de la méthode, je ne peux pas considérer ces deux résultats différents. et donc, je pense pouvoir considérer qu'il n'y a pas de cellules mortes dans ce cas précis.

La question est : est-ce que je considère que la valeur de l'écart entre qPCR et vqPCR est de 0 ou plutôt que cette valeur est la limite de détection de la méthode (parce que le résultat du calcul mathématique est négatif mais l'écart entre les 2 valeurs ne peut pas être considérés comme différent) ?

[Flyingbike]

votre exemple de 6.1E6 vs 6.6E6 est parlant. En quantification bactérienne, c'est identique. Effectivement là on est dans la variabilité expérimentale/technique, et clairement à votre place je considère que le delta est de zero car vous avez ~100% de cellules vivantes.

Par contre, je ne considérerais pas cela comme une mesure de LoD. Dans ce cas là il y a une définition bien précise et la détermination de cette limite peut être obtenue expérimentalement sans avoir recours à un artifice.


Je m'intéresse à cette technique que je n'ai pas encore expérimentée mais c'est une question de semaines.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Nosnibor]

La limite de détection a été mesurée expérimentalement par ailleurs.
Je ne voulais pas dire que ce problème me permettait de l'estimer.

Je me demandais si à la place de mettre 0 pour cet écart faible, il fallait plutôt noter la valeur de la limite de détection du test qPCR comme on noterait pour un dénombrement sur boite < 10 ufc par exemple. Sachant par exemple, que si la limite est à 2E3 unité génome/mL, un échantillon de niveau de population inférieur à cette limite ne peut pas être détecté. et donc à fortiori si c'est 0.
En même temps, je me dis que si il n'y a pas de cellules, elles ne seraient pas détectées en qPCR et donc si il n'y a pas d'amplification, on dirait bien que le niveau de la population cible est 0 = absence.

Je crois que je vais dire qu'il n'y a pas de cellules mortes dans ce cas. Effectivement, noter 0.

Merci pour vos réponses.

[Flyingbike]

ah ok j'avais mal interprété.

Donc votre valeur de seuil de détection deviendrait la valeur plancher du calcul de viabilité par qPCR. Dans ce cas ça me parait plutôt cohérent et plus rigoureux que de mettre zéro. La qPCR même si son seuil de détection théorique est de 1 copie a ses limites. Sur ma cible actuelle on est à 10E4/mL alors que sur ADN pur on est bien plus faible que cela....

[Nosnibor]

Merci pour votre aide.
Je pense que je vais faire comme ça et utiliser la limite de détection.