Extraction ADN champignon

[joana]

Bonjour,

J’aimerais extraire de l’ADN de champignon à partir de sa mise en culture sur boîte de Petri (ou en milieu liquide).
J’ai utilisé le kit EZ-10 Spin Column Fungal Genomic DNA Mini-Prep Kit de BIOBASIC, en ajoutant une étape de bain d’éthanol avec une incubation d’une nuit. J’ai également ajouté des billes de verre lors de l’étape de lyse.
Après PCR, réalisée avec les amorces ITS3 et FLR2, je n’ai obtenu aucun signal lors de la visualisation sur gel d’agarose à 1,5 %, 40 V pendant 1 h.

Quelles recommandations pourriez-vous me donner ? Quel protocole utilisez-vous ?

Merci d’avance.
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[agitateur]

salut.

Je n'ai aucun conseil à formuler de manière précise puisque ta question est trés précise.
Ce que je peux dire, c'est que l'extraction d'ADN qui m'a concerné il y a 25 ans était trés emmerdante et ça date trop dans mes souvenirs. Sans kit mais avec des ingrédients "séparés", j'ai dû faire varier la recette, versus la recette de base du gars passé avant moi sur CE champignon ( sauf que je travaillais sur d'autres "récoltes" ) et lui en thèse avait sa collection ADN suffisante pour ses 3 ans.
La "recette" de base me fournissait des qté faibles. En variant plusieurs paramètres, ça a augmenté considérablement.
Pour les amorces et sans chercher ce dont tu parles, tu as trés peu de chance de trouver une réponse ici ( sauf gros coup de bol avec qq'un qui travaille sur le même thème )

[Flyingbike]

Vous travaillez à l'aveugle, c'est joueur.

Quelle quantité de matériel de départ ? c'est assez critique. Et il vaut mieux pas assez que trop.

Ensuite, vous parlez de billes de verre, ce qui n'a aucun intérêt s'il n'y a pas d'étape mécanique pour les faire entrer en jeu. Le concept du bain d'éthanol, je ne suis pas sur de saisir de quoi il s'agit dans le contexte d'une extraction.

Après, vous sautez directement de l'extraction au gel. Les paramètres de migration, à cette étape, on s'en fout. Vous avez oublié le principal.

Aidez-vous !
- avez vous dosé votre extrait ? quelle concentration d'ADN ?
-Faire une PCR sur du matériel non validé et ne pas observer de signal, ca n'a a pas d'intérêt. Si vous ne pouvez pas valider la PCR, comment savoir si l'extraction, la PCR ou les deux ont foiré ? Pour cela on a un contrôle positif dans la PCR (ex. un ancien produit de PCR qui a fonctionné, ou un ADN extrait ayant été validé). S'il ne sort pas positif, on a au moins un problème de PCR. S'il est positif, on peut se recentrer sur l'extraction et la qualité du matériel obtenu.

Et même avant tout cela, on peut valider in silico. Quel est votre organisme de départ ? Un génome est-il disponible ? SI oui, avez vous validé les couples d'amorces ? D'ou viennent-elles ? Même si ça vient d'une publication (que dis-je, surtout si ça vient d'une publication), on fait une validation in silico (ex. Primer-BLAST).

Comme contrôle, on peut aussi utiliser une cible canonique, comme ITS2 avec des amorces universelles. Cela peut permetrte de valider la PCR et l'extraction, sur une cible controle.

Encore une fois, sur le fongique il n'y a pas un protocole de référence pour l'extraction d'ADN, il faut y aller petit à petit pour valider dans l'ordre. Il y a bien trop de paramètres en jeu (et la plupart sont plus critiques que le temps de migration ou la tension de la cuve dont on se cogne royalement à ce niveau là).
Avez-vous au moins un marqueur de taille ?

[agitateur]

Encore une fois, sur le fongique il n'y a pas un protocole de référence pour l'extraction d'ADN, il faut y aller petit à petit pour valider dans l'ordre.

C'est une façon plus directe et plus juste de formuler que la mienne plus haut ( mais bon, j'avoue, depuis le temps........ça a changé en outil bio mol )

Pour ce qui me concernait, il s'agissait d'un génome sans génome standard disponible, avec une ploidie non connue et variable. D'ailleurs, selon le stade de dev' et le substrat en place, la plus grande variation s'observait par la présence ou l'absence de certains transposons ( oui je sais celà parait totalement préhistorique à l'échelle de progrès sur ces outils et pourtant je date pas de l'age de pierre et je suis encore vivant).
Je ne dis pas celà pour le vélo qui vole et qui comprends trés bien ( et bien au delà du "savoir" que j'ai lâché il y a trés longtemps ) je dis ça pour Joana. Mon sujet portait d'ailleurs sur la présence ou pas des transposons dans une évolutions forte des populations en place, et l'évolution en quelques mois ( et un "substrat" naturel un peu différent ). La "bonne" sonde discriminante s'entendait sur un paramètre non encore connu de manière précise.
Pour la faire simple, en 6 mois plein temps, j'ai du passer 2 mois pour affiner l'extraction ADN, et 4 mois sur les sondes et les méthodes RFLP / AFLP en domaine trés peu connu.
Que les gens au fond de la classe, prés du radiateur et de la fenêtre, ne rient pas trop. Je parle d'il y a 25 ans. En bio mol génétique, c'est presque le moyen age.

Je ne doute pas qu'il existe en 2025 des qtés de kits plus affinés qu'il y a 25 ans, probablement. Mais un kit très généraliste pour attaquer du champi on peut s'en méfier comme la peste. Le champi n'est pas un sujet "facile".

La gestion parcimonieuse du stock est une question cruciale à ce stade.
Selon que les prélèvements "nouveaux" puissent être effectués rapidement ou pas du tout ( complications diverses, saisonnalité, substrat facile ou pas etc....). Et encore comme j'ai dit plus haut, une nouvelle collection de prélèvements a priori "identiques" pour l'extraction ensuite, ça peut réserver des surprises.

[A voir en vidéo sur Futura]