demande aide pour analyse en HPLC

[invite3af31f9f]

Je dois travailler sur un Chromatographe HPLC de Dionex (également spectro-fluorimètre), afin d'analyser des échantillons d'eau, et de détecter des traceurs fluorescents tels que l'éosine, l'uranine (fluoréscéine), rhodamine B, Thiosulfate de Sodium...

Il faut donc définir un gradient multi-step pour faire sortir les différents composants en une seule fois (pics clairs et séparés). Le but final étant de mesurer la concentration de ces composés en fonction des aires des pics (à l'aide d'une courbe d'étallonage)

La personne responsable de chez Dionex nous a expliqué qu'il fallait procéder à tatons:

- Injection d'un dose d'un composé bien définis
- Régler les ondes d'excitation et d'émission pour ce composé (pour le détecter)
- Observer le pic obtenu
- Noter le temps de rétention de ce composé correspondant au pic.

Ensuite il faut appliquer ce même gradient sur les autres composés (pris un par un), pour définir à chaque instant les paramètres excitation/émission du capteur fluorimétrique (pour qu'en une analyse chromatographie, tous les composants désirés soient quantifiés)

Le soucis, c'est que les pics se chevauchent fortement (également présence de pics parasites), et que la plus petite modification au niveau du gradient dérègle tous les temps de rétention (il faut donc reprendre à zéro en esssayant un autre gradient).

Existe-t-il une méthode pour définir un gradient correct, sans passer par de longues expérimentations fastidieuses ?

Peux-t-on définir le temps de rétention d'un composé en fonction de sa formule et du gradient imposé ?

Merci d'avance.
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[invite665a0d0b]

Bonjour
Bien que tu ne sois pas très bavard au sujet du type de chromatographie liquide utilisée, je te conseille de consulter un ouvrage spécialisé pour en savoir plus sur l’optimisation (p.ex. Caude Rosset Jardy Chromatographies en phase liquide et supercritique)
Le sujet du choix des conditions optimales de composition du solvant a été brillement illustré en chromatographie de partage à polarité de phase inversée par la méthode très élégante, des bandes de valeurs critiques (Colin, Krustlovic, Guiochon, Bounine, J. Chromatogr.,199,57,1980) ou l’on délimite des zones de présence de composés sur un diagramme log k’ f(composition solvant)
Le sujet est résumé dans le livre cité précédemment (troisième édition 1991)
Par contre je pense que le problème de la séparation des traceurs fluorescents a été largement traité p.ex. ici : http://www.eif.ch/fr/formations/chim...elet/belet.htm
Cordialement
rls

[laura7777]

Si tes pics se chevauchent et qu ils ne sont pas trop larges tu peux augmenter le % d'eau de ta phase mobile.

[jgiovan]

Tu peux aller un peu plus vite en faisant un mélange de tes substances, une fois l'ordre de rétention connu.

Une méthode classique consiste à effectuer un screening des conditions chromatographique en ne modifiant d'abord que les conditions initiales, par incréments de 5 % par exemple (de 90 à 10 % d'eau pour une analyse en phase inverse par exemple). Le meilleur chromatogramme de la série te donne le point de départ. Ensuite, tu fais de même pour les conditions finales.

Par la suite, tu peux ajouter un 3è solvant, créer des étapes etc.

[A voir en vidéo sur Futura]