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chromatographie hlpc détecteur uv



  1. #1
    audros

    Question chromatographie hlpc détecteur uv


    ------

    Bonjour,

    En tp j'ai injecté en chromato hplc plusieurs carbonyles pour connaitre leur temps de rétention, puis ensuite j'ai injecté un échantillon contenant plusieurs de ces carbonyles, j'ai reussi à les identifier par leur temps de rétention, mais je dois aussi déterminer leur concentration...
    j'ai obtenu des chromatogrammes donnant des V en fonction du temps de rétention, et j'ai noté l'aire sous les pics.

    j'aimerai savoir comment calculer la concentration de chacun des produits qu'on a injecté à partir de l'aire sous la courbe obtenu ?
    Merci beaucoup de vos réponses.

    -----

  2. Publicité
  3. #2
    jgiovan

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    salut,

    l'aire des pics est proportionnelle à la concentration en g/l de tes carbonyles dans la solution injectée.

    Si tu dispose de la concentration de chaque carbonyle dans la solution de référence, une simple règle de trois te permettra de calculer leur concentration dans ton échantillon.

  4. #3
    HarleyApril

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    Bonjour et bienvenue sur le forum
    Deux méthodes pour faire ton calcul, la première est plus exacte que la seconde
    première méthode
    Lorsque tu as injecté chacun de tes carbonyles, tu as injecté une quantité donnée et tu mesures une aire. Tu peux donc, inversement, en mesurant une aire, remonter à la quantité en faisant une règle de trois (ou règle du gamma)
    la concentration d'un produit sera alors cette quantité divisée par la somme des quantités

    deuxième méthode
    tu fais l'hypothèse que tous les produits ont le même facteur de réponse
    tu fais la somme des aires des pics de tous les carbonylés
    pour chaque pic, tu divises l'aire du pic par la somme
    tu auras ainsi la proportion de chaque constituant

    ces proportions sont des proportions molaires, bien évidemment, si ce sont des proportions massiques dont tu as besoin, il te faudra corriger avec les masses molaires

    cordialement

    [EDIT grillé par jgiovan]

  5. #4
    audros

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    Merci pour ces réponses,
    je vais apporter quelques précisions,
    pour jgiovan : pour les carbonyles de référence j'ai injectée avec des seringues de 200µl un produit mais sans connaitre la quantité exacte, ou la concentration, c'était une goutte de chacun des produits dans 10 ml de solvant.

    pour HarleyApril : je vais essayer ce soir de calculer avec la méthode des proportions mais je n'ai pas pu identifier tous les pics. Certain ne correspondant à aucun des carbonyles que j'ai en reference. Je pense que je dois quand meme en tenir compte dans les proportions, n'est ce pas ?
    Merci

  6. #5
    shaddock91

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    Citation Envoyé par jgiovan Voir le message
    salut,

    l'aire des pics est proportionnelle à la concentration en g/l de tes carbonyles dans la solution injectée.

    Si tu dispose de la concentration de chaque carbonyle dans la solution de référence, une simple règle de trois te permettra de calculer leur concentration dans ton échantillon.
    Bonjour
    Donc si tu ne connais pas les concentrations de tes solutions mères de "carbonyle", impossible de t'en tirer.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    HarleyApril

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    si !
    en admettant que les facteurs de réponses sont voisins
    on peut espérer que celui qui a conçu le TP a pris soin de prendre des composés de structures voisines

    pour les proportions, que tu prennes les autres pics ou non ne changera pas les proportions, mais t'allongera les calculs
    je m'explique
    imaginons que tu aies deux produits avec des aires 50 et 30 et un contaminant avec une aire de 20

    je prends toutes les aires
    la somme fait 100
    le premier fait 0,5 et le second 0,3
    la proportion est de 0,5 pour 0,3
    en normant par exemple à 100% ça fait 62,5% et 37,5%

    je ne prends que les pics concernés
    la somme fait 80
    les proportions sont 50/80=0,625=62,5% et 30/80=0,375=37,5%

    et voilou, une démonstration par l'exemple (merci de ne pas cafter en maths )

    cordialement

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  10. #7
    audros

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    Ce sont tous des carbonyles, formaldéhyde, puis acétaldéhyde, puis propanal, etc...
    Merci pour les proportions, j'avance grace à vous

  11. #8
    shaddock91

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    Citation Envoyé par HarleyApril Voir le message
    si !
    en admettant que les facteurs de réponses sont voisins
    on peut espérer que celui qui a conçu le TP a pris soin de prendre des composés de structures voisines

    pour les proportions, que tu prennes les autres pics ou non ne changera pas les proportions, mais t'allongera les calculs
    je m'explique
    imaginons que tu aies deux produits avec des aires 50 et 30 et un contaminant avec une aire de 20

    je prends toutes les aires
    la somme fait 100
    le premier fait 0,5 et le second 0,3
    la proportion est de 0,5 pour 0,3
    en normant par exemple à 100% ça fait 62,5% et 37,5%

    je ne prends que les pics concernés
    la somme fait 80
    les proportions sont 50/80=0,625=62,5% et 30/80=0,375=37,5%

    et voilou, une démonstration par l'exemple (merci de ne pas cafter en maths )

    cordialement
    Bien d'accord avec toi Harley pour cette approximation. Mais ce n'est pas parce que les 3 molécules ont un carbonyle que leur absorption UV à la longueur d'onde utilisée pour la détection aura la même intensité. Le problème est qu'on ne connait pas la marge d'erreur de cette approximation. Ca donne une idée, c'est déjà ça.

    Par contre si on a un spectro à barrette de diodes, c'est autre chose.

    Cordialement
    Dernière modification par shaddock91 ; 11/03/2009 à 15h47.

  12. #9
    invite2313209787891133
    Invité

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    Bonjour

    L'idéal serait encore de comparer les facteurs de réponse en passant un mélange avec des proportions connues; les proportions sont choisies de façon à approcher ce que l'on veux doser (le détecteur n'est pas tout à fait linéaire).
    Connaissant ces facteurs on peut alors multiplier chaque aire par ce facteur, et obtenir quelque chose de proche du pourcentage massique.

  13. #10
    audros

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    A propos de cas carbonyles, ils sont difficiles a voir en UV alors on leur fait une derivatisation au DNPH , c'est une sorte de condensation qui ajoute un chromophore.
    on obtient des hydrazones (carbonyles + chromophore)qui auront, normalement le même facteur de réponse..
    Donc si j'ai bien compris mon Tp la seule chose qui variera sera l'aire sous le pic qui depend de la concentration et le temps de rétention.....
    merci de votre aide

  14. #11
    HarleyApril

    Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    en effet, en faisant la dinitrophénylhydrazone, on doit avoir des facteurs de réponse très voisins
    reste le problème de non-linéarité, mais ce n'est sans doute pas dans le sujet du TP

    cordialement

  15. #12
    marseillfrance

    Exclamation hlpc détecteur uv

    bonjour tout le monde

    en effet, je travaille sur le dosage de la betamethasone goutte par HPLC

    étalon: dissoudre 50mg de betamethasone avec une solution à 1pour mille acide acetique glacial dans methanol et completer au volume de 50ml
    diluer 5ml de cette solution avec le meme solvant au volume de 50ml

    phase mobile: 70% eau - 30% acétonitrile

    j'ai rien obtenu comme resultat et je n'arrive pas a interpreter

    c'est quoi le probleme ??


  16. Publicité
  17. #13
    jgiovan

    Re : hlpc détecteur uv

    Citation Envoyé par marseillfrance Voir le message
    bonjour tout le monde

    en effet, je travaille sur le dosage de la betamethasone goutte par HPLC

    étalon: dissoudre 50mg de betamethasone avec une solution à 1pour mille acide acetique glacial dans methanol et completer au volume de 50ml
    diluer 5ml de cette solution avec le meme solvant au volume de 50ml

    phase mobile: 70% eau - 30% acétonitrile

    j'ai rien obtenu comme resultat et je n'arrive pas a interpreter

    c'est quoi le probleme ??

    Bonjour,

    Ca signifie quoi "pas de resultat" ?
    As-tu un pic chromato ou pas ?

    Pour effectuer ton dosage il te faut disposer de betamethasone pure dont une feras une solution de concentration connue proche de la concentration attendue de ton échantillon. Il ne te reste plus qu'à comparer l'aire de ton pic de référence avec celle du pic de l'échantillon à doser...

  18. #14
    marseillfrance

    Arrow Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    bonjour

    quand j'ai injecté l'étalon cité precedement j'ai obtenu plusieurs pics (7 à 8) mal séparés
    pourqoui ?

  19. #15
    marseillfrance

    Exclamation Re : chromatographie hlpc détecteur uv

    bonjour tout le monde , j'attends toujours votre aide
    je vais vous relancer ma question en détails ..

    dosage de la betaméthasone par HPLC:

    1- solution de référence
    transférer 50mg de bétamethasone de référence exactement pesée dans une fiole de 50ml
    dissoudre avec une solution a 1 pour mille acide acétique glacial dans méthanol et compléter au volume avec le même solvant , diluer 5ml de cette solution à 50ml avec le même solvant

    résultat
    j'ai obtenu des pics montagne mal séparés
    puis j'ai essayé d'injecter que le methanol seul juste pour voir , je me suis surprise par le même pic

    aider moi a interpréter ces résultats

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