HPLC droite d'étalonnage

[inviteac498da6]

Bonjour à tous, je bosse dans un labo pour mettre en place une méthode de dosage de la vitamine C par HPLC toute bête, je pensais tout allait bien se passer, mais je rencontre un léger problème que je vous expose.

Pour être concis, j'ai un problème de linéarité sur ma gamme étalon (après plusieurs essais et réduction sur ce qui me semble être le domaine le plus linéaire ) avec une incurvation nette de la courbe :

Courbe1.png


En réduisant encore l'éventail de concentration et en ajoutant des points sur ma courbe, j'obtiens un meilleur résultat, mais ma droite n'est pas linéaire, elle est affine avec une ordonnée à l'origine trop "élevée" selon moi :

Courbe 2.png

J'utilise un detecteur UV/vis à 245 nm et du coup, j'ai passé la même gamme étalon sur un spectro pour voir ce que ça donnait en mesure directe d'absorbance (en gros si le problème ne venait pas de moi et mes dilutions, ah ah) : linéarité très propre avant saturation à 3 UA :

Courbe 3.png

Est ce que cela vous semble normal ? Pourquoi une telle différence entre les deux courbes ? C'est surtout ce décrochage à basse concentration et le fait que ma droite soit salement affine qui m’effraie le plus.

Je vous donne les conditions opératoires :
-Chaine HPLC VARIAN Prostar
-phase mobile : H2SO4 0.04 N
-colonne : échangeuse d'ion Aminex
-débit =0.6 ml/min
-detection UV à 245nm

(L'étude a été faite il y a 5 ans dans un autre labo dans les même condition mais sur une autre chaine HPLC : linéarité très bonne en allant a des concentrations plus hautes que moi jusqu'à 600µg/mL)

Le problème peut-il venir de la sensibilité du détecteur ? De la lampe ? D'autres idées ?

Merci
-----

[sfnsfn2]

bonjour
la première chose, j'ai vu que vous avez tracé la hauteur du pic en fonction de la concentration, alors qu'en HPLC en trace la surface du pic en fonction de la concentration

2eme chose, vous avez passez de la chromatographie en spectrophotométrie UV-Vis: est ce que votre longueur d'onde est spécifique pour votre composé (pas d'interférence)

pour le passage d'un appareil à un autre, il faut valider la méthode et calculer les RSD.
la lampe peut donner des valeur différentes (elle a une durée de vie), sa sensibilité peut diminuer avec le temps.

[inviteac498da6]

Merci pour votre réponse.

Oui en effet, j'étudie bien la hauteur des pics car on me l'a explicitement demandé. J'ai moi même été surpris, mais et j'avais déjà fait la vérification, la différence entre les deux méthodes d'intégration n'est pas conséquente et ne solutionne pas le problème.

Quant à l'analyse sur le spectro, il s'agit bien de la même gamme étalon pour lequel j'ai fait un blanc (véritable, pas un placebo) à 245nm. Auparavant je me suis assurer d'être au maximum d'absorption a cette longueur d'onde par un balayage. Mes étalons sont constitués d'acide L-ascorbique en solution aqueuse acidifiée en présence d'edta : il me semble que seule la vitamine C absorbe dans l'UV.

Oui, je comprends bien que les deux appareils sont différents et possèdent un comportement propre, mais je reste dubitatif pour ma courbe sur le détecteur UV.

Un nettoyage de la cellule peut-il aider ? Je me suis renseigné et le manuel d'utilisation donne le lavage suivant :solution d'acide phosphorique à 25 %. Je n'ai pas d'acide phosphorique a disposition, quelqu'un aurait-il une autre solution a me proposer ?

Merci

[Gramon]

il me semble que tes valeurs d'absorbance sont élevées, essaye de diminuer le volume d'injection.

La loi de lambert-beer est valide pour les absorbances faibles.

[A voir en vidéo sur Futura]