HPLC bleu de méthylène non détecté

[Rayman223]

Bonjour,
Je suis actuellement en train de mettre au point une méthode HPLC pour détecter le bleu de méthylène et par la suite ses métabolites (via différentes enzymes)

Le problème est que je n'arrive pas à détecter le bleu de méthylène. J'ai tout essayé (enfin je crois).
J'ai passé la molécule avec 100%MeOH. Avec une boucle d'injection de 25 et même de 100 µl.
J'ai également essayé un gradient 10% MeOH 90% acide formique 0.1% jusque 90% MeOH.

Rien n'y fait, je ne vois absolument rien au alentour de 650-700 nm (sur 20 minutes de run).

Serait-ce ma lampe de Thungstène qui serait HS ? Alors que ma précédente molécule était bien visible à 425 nm (même HPLC).

Avez-vous une idée ?

la solution de bleu de méthylène injectée est bien bleue et à une concentration approximativement de 10 µM (j'ai essayé également plus concentré).


Merci d'avance !
-----

[Mr.Blue]

Bonjour,

La solution en sortie de l'HPLC est-elle bleue ?
Quelle colonne utilises-tu ?

[Rayman223]

Je viens d'essayer, je n'ai pas vu de couleur. J'ai également essayé sans la colonne, je ne vois pas de couleur. elle est sans doute trop diluée après injection pour que je la voie.

Dans le doute, le bleu de méthylène est bien soluble dans le méthanol, non ?

J'utilise une C18

[Mr.Blue]

Oui le bleu de méthylène est soluble dans le méthanol.

Étrange que tu ne vois pas une teinte bleue, même légère, en sortie de colonne. Tu pourrais essayer de concentrer ta solution éluée pour voir si le bleu apparaît.

As-tu vérifié s'il ne sortait pas dans le temps mort ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Rayman223]

J'ai vérifié la sortie dès que l'injecteur a commencé à tourner.

Je vais tester une plus forte concentration avec et sans ma colonne.

Je reviens

[Rayman223]

Ok, alors j'ai injecté une solution concentrée (bleu foncé) et sans colonne.
Je vois bien le bleu de méthylène sortir (3-4 gouttes). Ouf, c'est déjà ça.
Maintenant j'ai remis ma colonne et la, je ne vois plus de goutte. Par contre, en zoomant sur les axes de mon DAD, je peux apercevoir le spectre du bleu de méthylène mais il semble très peu concentré. Je suis à 2-3 mAbs ce qui est super faible surtout par rapport à la forte intensité de la couleur injectée.
De plus, je ne vois pas de goutte bleue à la sortie.

[moco]

C'est peut-être autre chose. S'il y a du glucose dans ta solution, le glucose détruit le bleu de méthylène, surtout si la solution est un peu basique

[Rayman223]

Glucose c'est impossible, je n'en ai pas injecté et la colonne est quasi neuve.
la solution est avec l'acide formique 0.1% soit pH2 à 2.5.
Par contre, est ce qu'il y aurait moyen que le bleu de méthyle se réduit ? Il serait alors incolore.

[Rayman223]

Ok, j'ai essayé avec une solution hyper concentrée. Je vois enfin le pic après passage dans ma colonne mais celui-ci est super faible malgré la boucle d'injection de 100 µl.

Quel est la valeur du coefficient d'absorption molaire du bleu de méthylène ? J'ai trouvé sur le net une valeur de 10^5 ce qui est énorme. Je ne devais pas avoir tant de problème pour détecter la molécule.

Je ne comprends vraiment pas le problème

[moco]

Essaie de faire une solution de bleu de méthylène et d'acide formique en tube à essais. Peut-être observeras-tu une décoloration ? Auquel cas ce serait la preuve que le bleu de méthylène serait réduit.

[Mr.Blue]

Le coefficient d'absorption molaire est autour de 80000 M^-1.cm^-1, donc tu devrais le voir facilement.
Je vois trois possibilités, soit il est réduit, soit il est dégradé (généralement en milieu basique, à voir si ce n'est pas aussi le cas à pH2), soit il s'adsorbe sur ta colonne (mais l'essai sans colonne aurait dû éliminer cette possibilité).

[Rayman223]

Ok, je vais voir s'il y a une réaction a pH2 et ou avec l'acide formique.

il s'adsorbe sur ta colonne (mais l'essai sans colonne aurait dû éliminer cette possibilité).

Je ne vois pas pourquoi l'essai sans colonne permet d'éliminer cette hypothèse.
Je vois mon produit sortir bleu sans la colonne mais je ne le vois pas (ou pas bien) sortir avec la colonne. donc l'adsorption n'est pas à éliminer non ?

[Rayman223]

Alors pour ce qui est de la stabilité, le bleu (la couleur) est stable dans ma solution d'acide formique pH2.
Donc il n'y a ni dégradation (sauf peut-être dans la colonne ?) ni réduction.

[Mr.Blue]

Oui au temps pour moi, j'étais resté à ton message de 10h43.
Il y a donc des chances (malchance plutôt) que ce soit de l'adsorption...

[Rayman223]

Houraa x)

Du coup, il vaut mieux éviter le gradient et mettre l'élution en isocratique avec 90% MeOH par exemple ?
Y a-y-il une autre solution ? car la, l'élution est alors trop rapide.

En tout cas, déjà un grand merci à vous 2 pour votre aide

[Mr.Blue]

Peut-être que la phase stationnaire n'est pas adaptée.
As-tu cherché des articles où le BM est injecté en HPLC ?

[Rayman223]

Le seul article que j'ai trouvé utilise une Waters Sunfire C18 column. La colonne que j'utilise n'est pas une Waters mais c'est bien une C18.

Mais bizarrement, je n'ai pas trouvé d'autres articles.

[Rayman223]

Ha je viens de voir. La différence est que ma colonne est une C18 endcapped.
Donc il faut que j'utilise une phase normal et non inverse. Mais je ne vois pas pouquoi une endcapped permettrait l'adsorption

[Rayman223]

J'ai vu avec horreur que tout mon système était contaminé au bleu de méthylène.
En effet, j'ai eu la bonne idée de refaire un passage de MeOH sans ma colonne et j'ai aperçus le spectre du bleu.
J'ai donc tout nettoyer a l'Acétonitrile (ACN).
J'ai remplacé tout le MeOH par l'ACN.

Je viens de refaire une injection de BM avec l'ACN et la, miracle, tout semble fonctionner.
Seul petit problème, avec 100% ACN, mon pic de BM se divise en 2. Je vais tester à pH acide en espérant un changement.


Du coup, je pense qu'il faut juste ne plus utiliser le méthanol. Pour une raison qui m'échappe, ce solvant n'est pas adapté.