Mode gradient en HPLC

[invite56df22dc]

Salut,

j'aurai aimé savoir quels étaient les inconvénients du mode gradient en HPLC ?
Et par la même occasion pourquoi sur une pompe HPLC, par couple de pistons montés en série, l'un des 2 est 2 fois plus gros que l'autre?

Merci d'avance
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[ChemHelp]

Ca dépend de l'utilisation que tu fais de l'HPLC. Si c'est pour des analyses d'échantillons tu es obligé de faire des gradients puisque tu ne connais pas la polarité des composés et avec un gradient ils vont forcément migrer durant celui ci. Le gradient sert également à "nettoyer" la colonne entre les échantillons.
Je ne comprends pas pourquoi tu cherches des inconvénients à un gradient en HPLC, d'autant qu'à ma connaissance, c'est probablement la seule technique employée.
Après s'il s'agit de purification de produits, tu peux peut être utiliser un isocratique si tu as déterminé auparavant un éluant convenanble (par gradient...)

Quant à ta deuxième question je pense qu'il s'agit juste d'une optimisation mécanique des pistons, ayant une meilleure efficacité dans ce cas.

[HarleyApril]

Je ne comprends pas pourquoi tu cherches des inconvénients à un gradient en HPLC, d'autant qu'à ma connaissance, c'est probablement la seule technique employée.

Bonjour

Si on peut faire en isocratique, on préfèrera cette méthode !
On utilise un gradient quand les temps d'analyse sont trop longs à cause de différences de polarités trop élevées entre les constituants d'un mélange.

Cordialement

[ChemHelp]

Je trouve que c'est largement subjectif, pareil pour les chromato flash, il y a deux écoles

[A voir en vidéo sur Futura]

[Kemiste]

Bonsoir.

Je trouve que c'est largement subjectif

Entre un isocratique où on peut injecter les échantillons à la suite et un gradient où il faut rééquilibrer la colonne entre deux injections (et donc "perdre" du temps), le choix est vite fait quand même...

[mach3]

Entre un isocratique où on peut injecter les échantillons à la suite et un gradient où il faut rééquilibrer la colonne entre deux injections (et donc "perdre" du temps), le choix est vite fait quand même...

et non... pas si simple... Justement l'isocratique peut poser problème au bout d'un certain nombre d'injections si il y a des impuretés très retenues dans les échantillons, elles vont s'accumuler en tête de colonne et finir par perturber la séparation, il faut le cas échéant passer un éluant fort de temps en temps pour tout nettoyer.
A l'inverse, en gradient, on est quasiment sûr qu'il ne reste rien sur la colonne, vu qu'on finit sur une grosse force éluante, et non, il n'y a pas besoin de rééquilibrer la colonne (enfin disons qu'il faut laisser à peine 5 minutes en fin de méthode pour que les artefacts passent) à chaque run, une fois qu'on a fait 3 ou 4 fois le gradient à vide, le système est généralement stationnaire.

j'aurai aimé savoir quels étaient les inconvénients du mode gradient en HPLC ?

inconvénients du gradient :

-la composition de l'éluant change au cours de l'analyse et ça peut être un gros souci avec certains détecteurs qui vont donner des lignes de bases inconstantes voire pourries voire pas de signal du tout, pour l'indice de réfraction par exemple, mais aussi pour de l'ELSD (et à certaines longueurs d'onde en UV-visible ça peut être l'enfer aussi)
-l'adaptation vers une colonne de dimension différente n'est pas toujours triviale (il y a des calculateurs, mais c'est pas toujours impeccable)
-la réponse d'un composé dépend du moment où il sort (parce que la composition de l'éluant change...), donc il y a intérêt à être constant dans la préparation des éluants, et/ou à vérifier la calibration tous les jours si on veut faire de la quantification
-corollaire du précédent, si on fait de l'HPLC chirale en gradient, il y a aura généralement une différence de réponse des deux énantiomères (vu qu'ils ne sortent pas au même moment) et l'excès énantiomérique ne s'obtient donc pas de façon directe, c'est notamment pour cela que l'on préfère les méthodes isocratiques en HPLC chirale.

Avantages du gradient (certains ont déjà été dit) :

-l'analyse est plus rapide (surtout si l'échantillon contient des analytes de polarité très diverses)
-les pics sont plus fins, souvent mieux résolus (l'inconvénient en isocratique, c'est que plus un analyte sort tard, plus le pic est large et donc moins intense, le rapport signal sur bruit chute, après une heure ou deux en HPLC il est souvent impossible de voir ce qui sort...)

m@ch3

[Kemiste]

A l'inverse, en gradient, on est quasiment sûr qu'il ne reste rien sur la colonne, vu qu'on finit sur une grosse force éluante, et non, il n'y a pas besoin de rééquilibrer la colonne (enfin disons qu'il faut laisser à peine 5 minutes en fin de méthode pour que les artefacts passent) à chaque run, une fois qu'on a fait 3 ou 4 fois le gradient à vide, le système est généralement stationnaire.

Pas si simple non plus. Si le gradient n'est pas important, rien ne garantit qu'il ne reste rien sur la colonne. Au contraire, si le gradient est important 5 min n'est pas forcément suffisant pour revenir à la composition initiale de l'éluant et rééquilibrer la colonne.