TP étalonnage
Bonjour,
Je me permets de vous interroger afin de mieux comprendre les différentes étapes demandées, je vous mets ci-dessous le détail du TP.
Je vais réaliser pour la première fois un suivi de croissance via un bioréacteur. Si je comprends bien l'unité de contrôle principale va me permettre d'obtenir les différents relevé de d'absorbance toutes les 20mn. J'imagine qu'il faut pour cela bien le paramétrer.
Je vais ensuite prélever 15ml de moût de fermentation centrifugé. Je récupère le surnageant et réalise un antibiogramme. J'avoue bloquer à cette étape car je ne vois pas du tout comment procéder dans le calcul des doses pour la réalisation de la gamme de l'étalonnage de l'antibiotique.
Qui peut m'expliquer, merci pour votre aide et le temps consacré.
Croissance et mise en évidence de la production d'une enzyme
La bactérie Bacillus licheniformis est une bactérie productrice de nombreuses enzymes dont une ß lactamase: enzyme hydrolysant les antibiotiques appartenant à la famille des ß lactamines.
Caractéristiques et utilisations industrielles de Bacillus licheniformis
Les conditions de croissance seront les suivantes :
• Bioréacteur Newbrunsweek 2 litres ou Bioréacteur BIOREA 4 litres,procédé discontinu
• Milieu de culture : bouillon nutritif ordinaire (1,6 litres ou 3.2 litres)
• Préculture de 18 h de Bacillus licheniformis en bouillon nutritif : volume de 100 mL ou 200 mL.
• Durée de la croissance: 6 à 7 heures
• température de croissance : 37 °C
• Agitation maximale: 300 rpm - Agitation minimale : 200 rpm
1.1- Suivi de la croissance :
Le fermenteur est inoculé avec la préculture à t=0, toutes les 20 minutes un prélèvement d'environ 5 mL sera réalisé sur lequel l'absorbance sera mesurée à 650 nm.
1.2- Mise en évidence de la production d'enzymes : ß-lactamase:
A l'issue de la campagne de fermentation, un prélèvement de 15 mL du moût de fermentation sera réalisé et ensuite centrifugé à 5000 tours/min pendant 10 minutes.
Le surnageant recueilli est filtré sur une membrane de 0,45 µm de porosité.
Le surnageant recueilli est analysé selon la technique utilisée pour la réalisation d'un antibiogramme.
2 géloses Mueller-Hinton coulées en boite de Pétri sont ensemencées avec une souche bactérienne « S « (souche de Staphylococcus aureus sensible aux pénicillines).
La technique utilisée est celle permettant de réaliser un antibiogramme : écouvillonnage à partir d'une suspension bactérienne dont l'opacité correspond à 0,5 sur l'échelle de Mc Farland.
L'une des suspensions est réalisée dans 5 mL de surnageant du moût de fermentation = suivi de production
La deuxième est réalisée dans 5 mL de bouillon nutritif stérile = témoin.
Attention : le trouble des 2 suspensions doit être identique
Un disque imprégné de pénicilline est ensuite déposé au centre de chacune des 2 boîtes.
Après incubation des 2 boîtes pendant 24 heures à 37°C, la comparaison du diamètre d'inhibition autour du disque de pénicilline sur la boîte témoin et sur la boîte essai permet de savoir si la production de ß-lactamase a été effective.
2 ème partie : Dosage d'un antibiotique dans un moût de fermentation (travail individuel)
Lors d'une campagne de fermentation précédente une souche de Penicillium notatum productrice de pénicilline a été cultivée pendant plusieurs jours et le moût de fermentation contenant l'antibiotique a été purifié.
L'objectif de la manipulation est de déterminée la concentration en pénicilline présente dans ce moût.
Matériel et réactifs:
• 2 tubes de 10 mL de gélose Mueller-hinton en surfusion (étuve à 55°C)
• 1 flacon de 20 mL d'eau physiologique stérile
• 1 tube, noté «ab étalon» contenant 10 mL de pénicilline à 0,32 µg.mL-1
• 1 tube à hémolyse contenant 3 mL d'un extrait du moût de fermentation
• 1 tube contenant une suspension de bactérie sensible à la pénicilline : Bs
• 2 boites de Pétri stériles
• Pipettes de 1mL ou pipette auto (P1000) + cônes bleus stériles
• tubes à hémolyse stériles
• 7 cônes jaunes stériles
• 13 disques de papier filtre stérile
• 4 feuilles de papier filtre découpées à la dimension d'une boite de Pétri
• 1 feuille d'aluminium
Mode opératoire :
Préparation des 2 boîtes de milieu; ensemencement de la souche sensible :
Par boîte de Pétri (90mm): ajouter 1 mL de la suspension bactérienne Bs à 10 mL de gélose Mueller-Hinton en surfusion et refroidie à 45 °C; homogénéiser et couler. Préparer 2 boîtes.
Préparation des solutions étalons de pénicilline:
A partir de la solution étalon mère de pénicilline, préparer par dilution en eau stérile, quatre solutions étalons de concentrations finales allant de 0,16 à 0,02 µg de pénicilline /mL.
Déposer les disques de papier sur les géloses Mueller-Hinton ensemencées et solidifiées en respectant le gabarit fourni.
Imprégnation des disques:
- Déposer 15 µL des solutions étalons de pénicilline (2 essais /concentration)
- Déposer 15 µL de l'extrait de moût de fermentation (2 essais)
- Préparer un disque témoin (à déposer au centre d'une des 2 boîtes)
Laisser diffuser l'antibiotique, environ 30 minutes, boîte fermée bien à plat.
Préparation de la chambre humide (1 chambre / boîte):
Retourner la boite de Pétri sur une feuille de papier filtre préalablement humidifiée et placée sur la feuille d'aluminium.
Recouvrir d'une feuille de papier filtre préalablement humidifiée.
Envelopper l'ensemble de papier aluminium.
Incuber les boites à 37°C pendant 24 heures.
• Présenter sous la forme d'un tableau, la réalisation de la gamme d'étalonnage de l'antibiotique.
-----
-----