Nouveau mode de prélèvement PCR

[christophej]

Bonjour,

Je viens partager une idée pour un nouveau mode de prélèvement PCR (libre en open source) alternatif au prélèvement nasal à l'aide d'un écouvillon.

Le principe est le suivant:
On prend un filtre à café que l'on place dans un porte-filtre. On déclenche un éternuement avec du poivre moulu (testé) ou autre. On éternue dans le filtre. On place le filtre dans un sachet ZIP, et on place le tout dans une enveloppe avec ses coordonnées. On dépose l'enveloppe dans une boîte prévue à cet effet.

Avantages:
Le prélèvement peut être réalisé soit-même. Le métier de préleveur est stressant en raison du risque, d'où une difficulté de recrutement. On pourrait aussi proposer un prélèvement par écouvillon en self service mais c'est assez douloureux, surtout si on a pas l'habitude et qu'on veut aller trop vite (j'ai testé avec un coton-tige).
C'est indolore.
C'est plus économique, pas de frais de prélèvement.
Plus rapide et permet d'augmenter la capacité de test, le prélèvement est souvent le goulot d'étranglement qui augmente le temps de dépistage.
Tout le matériel existe déjà et est peu coûteux.
Coté labo, la manip consiste à tremper le filtre dans de l'eau pour récupérer les virions et à transvaser dans une éprouvette avec le réactif et mise en machine. L'opération est peu gourmande en main d'oeuvre.

Et enfin le point essentiel, quel sera la sensibilité de cette méthode comparée à l'écouvillon?
Sachant que le nombre de virions expulsé lors d'un éternuement est beaucoup plus élevé que lors de la respiration (plusieurs millions contre quelques dizaines par minutes) je m'attends à une très bonne sensibilité. Il faudrait vérifier ce dernier point avec un test quantitatif comparatif.
Donc si vous connaissez un labo qui accepte de se prêter à l'expérience...

En vous remerciant par avance, n'hésitez pas à partager.
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[noir_ecaille]

Sauf qu'on écouvillone justement pour récolter des cellules muqueuses (en principe mortes) et que l'éternuement n'entraînement majoritairement (exclusivement ?) le mucus et les poussières plus au centre de la lumière nasale.

De plus, si le labo pratique la méthode par pool, alors il est d'autant plus important de limiter la dillution au prélèvement (ce qui n'est pas le cas de l'éternument, au contraire...).

Bref. Bien "essayé" mais malheureusement insuffisant

PS : S'ils pouvaient se passer de matériel coûteux (surtout en ces temps de pénurie), croyez bien que les personnels de laboratoires mettraient en oeuvre d'autres alternatives de prélèvement.

[Flyingbike]

Grillé !

tant pis, je réponds quand même en différent.



Le matériel de prélèvement, comme celui utilisé pour la détection des pathogènes, est considéré comme un dispositif médical de diagnostic in vitro (https://www.ansm.sante.fr/Activites/...es/(offset)/9).
Ils sont donc soumis au marquage CE et répondent à des critères de contrôle qualité assez complexes. Je doute qu'on y arrive avec des "filtres a café emballés dans un sachet à zip". Sachez également que le transport d'échantillons humains à visée diagnostique se fait dans un emballage qui répond également à des normes. C'est déjà mal parti mais admettons...

Comme dit au dessus, il faut déjà que l'échantillon contienne suffisamment d'ARN pour que la sensibilité soit suffisante. Cela reste à démontrer, il me semble que les tests salivaires ont une sensibilité médiocre. Vous vous "attendez à une très bonne sensibilité" mais cette affirmation est sortie d'un chapeau. Mais bon, admettons.

Ensuite, le SARS-CoV2 est un virus à ARN. L'ARN est une molécule relativement fragile qui ne supporte pas longtemps la température ambiante si on n'a pas pris de précaution pour le protéger, il existe tout un tas d'astuces mais le filtre à café n'en fait pas partie. Vous avez toutes les chances de ne récupérer aucun matériel exploitable à l'arrivée. Mais bon, admettons.

Pour exploiter l'échantillon, il faut extraire l'ARN. Comme dit par noir_ecaille, pour avoir une sensibilité suffisante, il ne faut pas trop "le diluer". Comment récupérer l'éventuel ARN déposé sur tout un filtre a café ? Avec 10mL d'eau ? Et ensuite, on fait quoi, on fait une ultracentrifugation pour récupérer les virions ? Expérimentalement, il n'est pas du tout aisé de récupérer des ARN très dilués dans un si grand volume.
Quand vous dites "la manip consiste à tremper le filtre dans de l'eau pour récupérer les virions et à transvaser dans une éprouvette avec le réactif et mise en machine. L'opération est peu gourmande en main d'oeuvre" vous n'en savez rien. Il faut d'abord extraire/purifier l'ARN, certainement pas avec de l'eau, mais avec des micro-colonnes d'affinité et des réactifs très spécifiques. "Dans une éprouvette avec le réactif", c'est pas vraiment cela. Les volumes de travail en qPCR sont de l'ordre de 10-20µL. Mais avant la PCR, il faut le rétrotranscrire, car c'est un virus à ARN.

Pour résumer, ce que vous pensez être des avantages n'en sont pas du tout, bien au contraire, et je pense vous avoir donné suffisamment d'indices pour que vous concluiez vous même que ce n'est pas du tout du tout une bonne idée

Bonne soirée

[FabiFlam]

Sinon, le poivre moulu ne gène pas du tout la détection du virus ?

FabiFlam

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

Normalement non, mais c'est tellement un détail à ce niveau la. (il faut avouer que le mode de prélèvement est original, cependant)

[christophej]

Bonjour,

Je passe sur l'aspect réglementaire qui est plus du domaine de la politique que de la science qui nous occupe ici.

Comme dit au dessus, il faut déjà que l'échantillon contienne suffisamment d'ARN pour que la sensibilité soit suffisante. Cela reste à démontrer, il me semble que les tests salivaires ont une sensibilité médiocre. Vous vous "attendez à une très bonne sensibilité" mais cette affirmation est sortie d'un chapeau.

C'est justement là le coeur du problème. Les tests par écouvillon ont un taux de faux négatifs très important, environ 30% selon les sources, souvent attribués à un mauvais prélèvements.

Pour la sensibilité, je me base sur cette source:
https://www.erinbromage.com/post/the...hem-avoid-them
qui se base sur la grippe (je n'ai pas trouvé d'étude équivalente pour le Sarscov2) et donne 200.000.000 virions expulsés lors d'un éternuement contre 33 par minutes pour la respiration.

Or si j'ai bien compris le problème, (ce n'est pas du tout mon domaine) l'amplification PCR est très sensible et est capable de répliquer un seul virion à l'infini. La quantité de virions récupérée ne serait pas un problème, on pourrait même ce permettre d'en jeter 99%. C'est plutôt la pollution qui serait à prendre en compte, la bonne question à se poser est donc de savoir si on a une meilleur pureté avec cette méthode. Dans le cas d'un éternuement, les gouttelettes viennent directement des poumons, voilà pourquoi je m'attend à une meilleure pureté que dans la salive par exemple, que j'imagine plus polluée (mais je peux me tromper car je n'ai aucune prétention dans ce domaine).
J'ai lu aussi qu'on allait chercher le virus dans les poumons lors de test post mortem pour une meilleur sensibilité, mais je ne retrouve pas la source.
Mais le plus simple et le plus rapide pour trancher, serait qu'un laborantin accepte de prendre quelques heures de son temps pour faire l'expérience, d'où un message sur un forum public.

Ensuite, le SARS-CoV2 est un virus à ARN. L'ARN est une molécule relativement fragile qui ne supporte pas longtemps la température ambiante si on n'a pas pris de précaution pour le protéger, il existe tout un tas d'astuces mais le filtre à café n'en fait pas partie.

J'ai lu que l'embout des écouvillons est en coton. On peut remplacer le filtre papier par un filtre en coton, si c'est le papier pose problème.

Pour exploiter l'échantillon, il faut extraire l'ARN. Comme dit par noir_ecaille, pour avoir une sensibilité suffisante, il ne faut pas trop "le diluer". Comment récupérer l'éventuel ARN déposé sur tout un filtre a café ? Avec 10mL d'eau ?

Pour récupérer l'ARN du filtre à café avec 10mL de solvant (eau ou autre?), je l'enroule autour d'une paille et je le plonge dans une éprouvette de 12mm de diamètre remplie à 10cm de solvant.
Cette opération me prend 20 secondes (plus opérations d'hygiène entre chaque manip).

Je suppose que pour l'écouvillon on fait une opération similaire, certes on peut réduire la quantité de solvant.
Le reste est identique avec les deux modes de prélèvement.

[Flyingbike]

Je passe sur l'aspect réglementaire qui est plus du domaine de la politique que de la science qui nous occupe ici.

EH bien désolé mais non. Ce n'est pas de la politique, cela concerne la sécurité des patients, des préleveurs et de toute la chaine jusqu'au résultat (transport, analyse, etc). Et cela garantit la fiabilité du dispositif. Donc passer cela c'est une vulgaire pirouette pour se raccrocher aux branches.

C'est justement là le coeur du problème. Les tests par écouvillon ont un taux de faux négatifs très important, environ 30% selon les sources, souvent attribués à un mauvais prélèvements.

Rien ne dit que l'éternuement donnera un meilleur prélèvement. A mon avis ce n'est pas le cas puisqu'il sera dilué.

qui se base sur la grippe (je n'ai pas trouvé d'étude équivalente pour le Sarscov2) et donne 200.000.000 virions expulsés lors d'un éternuement contre 33 par minutes pour la respiration.

La grippe est une toute autre maladie et le virus est d'un tout autre type

Or si j'ai bien compris le problème, (ce n'est pas du tout mon domaine) l'amplification PCR est très sensible et est capable de répliquer un seul virion à l'infini.

EN théorie oui, mais en pratique non. La preuve : il y a des faux négatifs

Dans le cas d'un éternuement, les gouttelettes viennent directement des poumons, voilà pourquoi je m'attend à une meilleure pureté que dans la salive par exemple, que j'imagine plus polluée

C'est possible, mais à vérifier

J'ai lu que l'embout des écouvillons est en coton. On peut remplacer le filtre papier par un filtre en coton, si c'est le papier pose problème.

Cela ne résout pas le problème du transport et de la stabilité du virus. L'ARN est une molécule fragile.

je l'enroule autour d'une paille et je le plonge dans une éprouvette de 12mm de diamètre remplie à 10cm de solvant.
Cette opération me prend 20 secondes (plus opérations d'hygiène entre chaque manip)

ET APRES, que faites vous de cette sauce ? Savez vous comment on purifie des ARN ?

Je suppose que pour l'écouvillon on fait une opération similaire, certes on peut réduire la quantité de solvant.
Le reste est identique avec les deux modes de prélèvement.

Ce que vous pensez être similaire ne l'est pas du tout.
Quelques mg de muqueuse sur l'extrêmité d'un écouvillon qui sera plongé dans 1 ou 2mL de solution, cela vous semble similaire a votre "filtre a café qu'on trempe dans une éprouvette", mais dans les faits, cela n'a strictement rien à voir.

Mais le plus simple et le plus rapide pour trancher, serait qu'un laborantin accepte de prendre quelques heures de son temps pour faire l'expérience, d'où un message sur un forum public.

Vous n'avez pas compris qu'on ne joue pas dans un laboratoire. Il y a des normes, et de toute façon cette expérience ne pourra aller plus loin qu'une idée sur un forum, pour les raisons évoquées plus haut.

[noir_ecaille]

Je passe sur l'aspect réglementaire qui est plus du domaine de la politique que de la science qui nous occupe ici.

Faux, croyance erronée. La réglementation s'appuie sur la politique mais le standard utilisé a été qualibré scientifiquement et pas pour le plaisir mais par nécessité.

C'est justement là le coeur du problème. Les tests par écouvillon ont un taux de faux négatifs très important, environ 30% selon les sources, souvent attribués à un mauvais prélèvements.

Ce serait pire avec votre proposition, de trrrrrèèèèès très loin. Faites donc la formation complète pour apprendre à manipuler en laboratoire et pas juste la partie théorique (donc faire la partie pratique aussi). Ca vous donnera un bon aperçu de la raison d'être des matériels et méthodes qualibrées.

Mais comme vous n'avez aucune idée (c'est limpide) de comment sont fabriqués ces matiériels, vous brodez à partir de vos propres idées que vous pensez géniales parce que vos lacunes vous empêchent même de comprendre où est la bêtise/erreur. C'est sûr qu'avant de savoir lire et écrire, on a tous tenté des immitations en s'auto-racontant des histoires. Parce qu'avant de savoir on est forcément ignorant, parfois/souvent même de l'étendue de sa propre ignorance.

Donc je passe sur le reste par égard pour tout le monde mais en résumé : c'est n'importe quoi. Il n'y a rien de personnel, mais par pitié n'essayez pas d'être plus royaliste que le roi ou de vous croire plus génial que les professionnels du domaine.

EDIT : grillée par Flyingbike

[christophej]

Rien ne dit que l'éternuement donnera un meilleur prélèvement. A mon avis ce n'est pas le cas puisqu'il sera dilué.

La bonne question à se poser est d'où viennent ces 30% de faux négatifs?
Mauvais prélèvement? Le virus était là mais on l'a mal cherché.
Quantité insuffisante?
Quantité suffisante mais trop d'ADN parasite?

La grippe est une toute autre maladie et le virus est d'un tout autre type

Oui, personnellement je trouve regrettable de devoir me rabattre sur une étude portant sur la grippe, faute d'avoir les chiffres sur le Covid après 6 mois de pandémie, ce qui constituerait pourtant le B.A.BA de l'épidémiologie.

Cela ne résout pas le problème du transport et de la stabilité du virus. L'ARN est une molécule fragile.

D'accord, mais pour le prélèvement par écouvillon, on le résout comment ce problème?

ET APRES, que faites vous de cette sauce ? Savez vous comment on purifie des ARN ?

Non, mais dans le cas du prélèvement par écouvillon, on fait comment?

Vous n'avez pas compris qu'on ne joue pas dans un laboratoire. Il y a des normes, et de toute façon cette expérience ne pourra aller plus loin qu'une idée sur un forum, pour les raisons évoquées plus haut.

Oh si! Je connais très bien ce problème de normes, une maladie française (le pays des 400.000 normes ) dont on a vu les effets durant cette crise. Mais il reste quand même un petit espoir, il y a un peu plus de 100 pays, chacun avec ses normes et protocoles, et pourtant certains labos ont fait preuves d'ouverture et d'ingéniosité et des initiatives citoyennes ont vu le jour, par ex:
https://app.jogl.io/project/118
https://hackcovid19.bemyapp.com/#/pr...fd2e001b93b10b

Je propose ici une expérimentation libre de droit, ni plus, ni moins, je n'irai pas plus loin, libre à chacun d'en faire ce qui lui plait en prenant ses propres responsabilités.

[FDFD]

Bonjour,

Je remets ici le lien mis par flyingbike dans la discution sur le pooling que j'avais initiée:
https://www.eurofins-biomnis.com/faq/

Je ne souhaite pas revenir sur la discussion sur le pooling mais je voudrais souligner qu'il y a des normes françaises qui interdisent une pratique qui marche (le pooling)...
D'ailleurs cette méthode est utilisée en Allemagne..

[noir_ecaille]

Hors sujet, qui confond norme iso et "tambouille amusante".