Définir des amorces.

[invitedfaa3fb6]

Bonjour à toutes et tous,

Comme indiqué dans ma présentation, je souhaite passer des concours de techniciens biologistes (j'ai indiqué un préfixe licence par défaut, à vrai dire).


Une question dans l'épreuve écrite revient régulièrement. Je bloque dessus malgré le fait que je me sois renseigné plusieurs fois à ce sujet. Il s'agit de définir des amorces, à la main. Autant quand un programme ou un site le fait, on ne chipote pas, autant là, je nage dans un brouillard de bases nucléiques.


Ce que j'en sais, c'est qu'il faut un minimum de 15-18 bases. Que la proportion en GC doit être de 50% environ. Que le couple d'amorces doit avoir une température d'hybridation équivalente (même si ça, à la main, c'est délicat..). Également l'amorce ne doit pas aller se recoller quelque part.

Afin d'avoir votre avis, je vous présente l'exercice incriminé (lien ci dessous). Comme je n'aurais jamais de corrections puisque c'est une question de concours, vous consulter me permettra d'avoir de nouveaux avis sur la question.


http://www.servimg.com/image_preview...116&u=11018042


Pour ma part, je prendrais très bêtement les 15 premières et les 15 dernières bases en partant de chaque côté (et en respectant le sens 5' 3'). Mais d'une, plusieurs choses me turlupine, à commencer par le "oligonucléotide 15-mers". Le fait que cela soit double brin m'a gêné au début. Finalement, la PCR ne travaille que sur un brin, donc on choisit n'importe lequel en définitive.Pour en avoir fait un certain nombre au laboratoire (de pcr), je suis étonné de la formulation de la question.


Merci d'avance pour votre avis.
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[TanguyE]

Bonjour,

15-mers signifie tout simplement 15 unités, donc ici 15 nucléotides.

Ici, il vous est demandé de donner les 2 oligos pour amplifier ce fragment, donc pas besoin de considérer le % en GC ni la Tm.

Ce qui donne les primers suivants:

5' ATGGGCTAGCTGATC 3'
5' ACACGATCCAAAGCT 3'

L'avantage d'avoir le double brin c'est qu'il est plus facile de trouver l'amorce reverse, même si on peut facilement définir des amorces avec seulement le brin sens.

[invitedfaa3fb6]

Bonjour TanguyE,

Merci pour ta réponse. C'est plus simple que cela en a l'air. J'avais bon pour le premier fragment. Pour le second, je n'avais pas réalisé que la pcr se déroulait sur les deux brins en même temps (pourtant ça parait évident).

J'en viens du coup à une question concernant la phase d'élongation de la pcr. Les amorces sont hybridés chacune sur un brin, puis il est temps pour la taq de polymériser les séquences. La Taq continuera jusqu'à la fin de la phase d'élongation. Mais justement, c'est là que je m'étonne. Comment faire pour que la Taq stoppe à la fin du fragment d'intérêt? Il y a une amorce que d'un seul côté du brin, il n'est donc pas borné. Ne polymérise-t-on pas davantage que la séquence d'intérêt? La preuve que non, pour avoir fait plusieurs PCR. Je ne saisis pas ce qui fait arrêter la Taq au bon endroit, je croyais que le fragment d'intérêt était borné par le couple d'amorce.

Merci par avance de m'éclairer,
Cordialement.

[Flyingbike]

regarde ici http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/pri...esentation.htm
tu devrais comprendre

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitedfaa3fb6]

Bonjour,

Je connaissais cette animation mais le fait que tu me l'ais remises sous le nez m'a permis de voir exactement ce qui manquait dans ma connaissance de ce processus. Je te remercie pour ton aide et je suis ok sur la PCR.

Cordialement à tous.