Bonjour,
Dans un exercice, on m'a proposé une séquence de gène à amplifier. La question était : Choisir deux amorces adaptées.
Ma réponse : Les 21 premiers nucléotides de la séquence dans le sens 5' vers 3'. (21 n est la longueur imposée pour une amorce)
Pour l'autre amorce, j'ai pris les nucléotides complémentaires des 21 premiers nucléotides en partant de la FIN de la séquence proposée !
Est-ce une bonne réponse ?
Merci
Bonjour,
Absolument pas, il n'y a aucunes règles imposant d'avoir 21 nucléotides, c'est juste une moyenne utilisée, mais de bonnes amorces font environ 18 a 25 nucléotides21 n est la longueur imposée pour une amorce
non plus,Les 21 premiers nucléotides de la séquence dans le sens 5' vers 3'.
ou serait la difficulté si il s'agissait juste de prendre une 20aine de nucléotides peu importe le reste,
en l'occurence il y a plusieurs règles a suivre, peut etre que ta séquence y colle, mais tu n'as pas l'air d'avoir vérifié a priori
pareil pour le reverse, il ne suffit pas de prendre le complementaire du final (sinon ca ne donnerait pas lieu a un exercice, je pense que n'importe qu isait compter jusqu'a 20 en partant du début et compter jusqu'a 20 en partant de la fin)
notamment tes amorces doivent avoir un GC% entre 40 et 60, une Tm entre 55 et 68°C, et certaines bases sont a éviter en position 3' terminale, tu dois aussi verifier certains motifs comme si il y a 4 ou 5 "G" d'affilés a la fin, ce qui mène a des structures secondaires, et regarder que tes amorces ne s'hybrident pas entre elles
Bonne chance
Edit: Ah et j'oubliais, ton amplicon doit faire entre 200 et 3000 bases environ
Dernière modification par Loupsio ; 21/06/2015 à 18h34.
Merci beaucoup pour les précisions.
Mais du coup, dans le cadre de l'exercice, comment doit-on faire ? Créer les séquences d'amorces "de toutes pièces" en respectant les règles que tu as citées ?
Je suis un peu perdu.
il existe des programmes pour ca dans la vie courante, mais si tu dois le faire sans programme, tu dois prendre un morceau de la sequence qui t'es donnée (par exemple celle que tu as) compter le pourcentage de CG dedans (rien de bien compliqué, un simple calcul de pourcentage), pour le calcul de la Tm je pense que tu peux utiliser le calcul simplifié c'est a dire (A*2)+(T*2)+(G*4)+(C*4), si la temperature est trop basse tu rajoute quelque nucléotides, si elle est trop haute tu en enlèves, tout en restant entre 18 et 25 nucleotides et je crois que c'est mieux de ne pas avoir un G en position terminale
quand tout correspond, tu verifie que les extremitées (surtout 3') de tes amorces ne sont pas complementaires (une dans un sens l'autre dans l'autre quand tu vérifie) histoire de vérifier qu'elles ne s'hybriderons pas,
J'ai compris ! Merci beaucoup pour tes explications !
Ma réponse proposée dans mon premier post est donc juste si elle respecte les critères que tu as cités. Merci encore.
Une autre question sinon : Existe-t-il des calculs pour déterminer la durée des différentes étapes de PCR ?
La durée de cycles tu veux dire? Celle ci t'es donnée par le fournisseur de la polymerase, cela dépend de sa vitesse d'action, une Taq pol normal c'est 30 secondes d'elongation si le fragment a amplifier est inferieur a 3kb + 30 secondes supplementaire par kb, après d'autres poymerases comme la phusion sont rapides et meme pour de plus grands fragments, de petits temps suffisent, pour les autres temps (autre que le temps d'elongation qui est le troisieme parmi les trois temperatures que tu repetes sur plusieurs cycles) ce sont des temperatures qui servent a séparer le double brin et la temperature d'hybridation de tes amorces, donc ca du moment que la température est la bonne, le temps que tu laisse n'a pas trop possibilité de varier, par exemple si tu a un GC% tres grand, ca va etre plus dur a séparer mais laisser plus longtemps ne joueras pas trop, en tout cas pas autant que d'augmenter la température, donc non ces temps la tu suis ce que dit le fournisseur et c'est bon
