technique SAGE

[inviteb65f2ecd]

Bonjour à toutes et à tous,

Je me pose un certain nombre de question au sujet de la technique SAGE et de ces altérnatives qui doivent faire l'objet d'une présentation sous peu. Je vous soumets mes interrogations.

Trop souvent les tags produits par la méthode SAGE ne sont pas assez complexes pour faire correspondre directement la séquence tag avec celle du génome.
Connaîtriez-vous une stratégie similaire à SAGE et qui non seulement permettrait de faire correspondre spécifiquement les séquences tag avec celle du génome tout en conservant l'avantage de quantifier l'expression génique en donnant une information de plus de 30 tags valides par séquencage. Mais également qui tiendrait compte des séquences introniques ? Je pensais aux puces mais mes connaissances en la matière ne sont pas suffisamment sûres pour être persuadé de ma réponse.

Savez-vous comment se calcule la complexité des tags formés et la probablité de matcher spécifiquement dans le génome ?

Enfin, il me paraît important de discuter les avantages et les inconvénients de cette téchnique altérnative comparativement à SAGE.
Savez-vous chez quelle compagnie il faudrait se fournir en nouveaux enzymes ?
Y aurait-il des modifications à appoprter en matière de traitement de données bioinformatiques ?

Merci pour les réponses qui me seront appartées,
amicalement
Belouga
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[invitec9f0f895]

salut,

Bon je ne pourrais pas repondre a tout. voici quelques pistes.
Le problemes des tags est leur petite tailles, et donc leur probabilite elevée d'etre trouve par hasard dans le genome. Je ne connais pas de techniques alternatives, mais en effet les puces a ADN sont utilisables. Seulement il faut possedet un jeu de puce couvrant l'integralite du genome. CE qui est une limitation importante.

Un tag a une probablite de 1 sur N⁴ d'etre present aleatoirement dans le genome. (N represente le nombe de base du tag). Maintenant en pratique c'est quelque peu different car toutes les bases n'ont pas la meme probabilite d'apparition au sein d'un genome. Certains sont plus ou moins riche en G et C qu'en A et T.
Une foi sequence le tag est compare a la base de donnee pour identifier la region a laquelle il correspond. Ca implqiue donc de connaitre 'lintegralite du genome. Ensuite une autre limitation de la technique est le taux d'erreur lors du sequencage. Si une erreur apparait durant le sequençage le tag sera erroné et il sera impossible de predire sa localisation. Donc un sequencage fidele est critique dans la qualite des resultats.

Pour ce qui est des sequences introniques, l'interet me semble limiter. En effet le but est de n'obtenir que des ADNc (provenant d'un ARNm). Or l'intron n'etant present qu'au stade pre-ARNm, et ceux ci etant restreint aux noyaux, il me semble que les preARNm ne seront pas en assez grand nombre pour etre significatif. Sans compte qu'un preARNm n'est pas forcement poly adénylé, ce qui le rends difficilement séparable de l'ADNg or si tu as la moindre contamination par de l'ADN génomique ton experience est fichue, car tu ne regardes plus l'expression d'un gene. C'est d'ailleur une autre limitation , qui est que cette technique est difficilement utilisable pour des ARNm peu exprimes, car la probabilite d'arriver a les cloner est faible.

j'espere que ca t'aidera.
Yoyo

[inviteb65f2ecd]

salut,

Bon je ne pourrais pas repondre a tout. voici quelques pistes.
Le problemes des tags est leur petite tailles, et donc leur probabilite elevée d'etre trouve par hasard dans le genome. Je ne connais pas de techniques alternatives, mais en effet les puces a ADN sont utilisables. Seulement il faut possedet un jeu de puce couvrant l'integralite du genome. CE qui est une limitation importante.

Un tag a une probablite de 1 sur N⁴ d'etre present aleatoirement dans le genome. (N represente le nombe de base du tag). Maintenant en pratique c'est quelque peu different car toutes les bases n'ont pas la meme probabilite d'apparition au sein d'un genome. Certains sont plus ou moins riche en G et C qu'en A et T.
Une foi sequence le tag est compare a la base de donnee pour identifier la region a laquelle il correspond. Ca implqiue donc de connaitre 'lintegralite du genome. Ensuite une autre limitation de la technique est le taux d'erreur lors du sequencage. Si une erreur apparait durant le sequençage le tag sera erroné et il sera impossible de predire sa localisation. Donc un sequencage fidele est critique dans la qualite des resultats.

Pour ce qui est des sequences introniques, l'interet me semble limiter. En effet le but est de n'obtenir que des ADNc (provenant d'un ARNm). Or l'intron n'etant present qu'au stade pre-ARNm, et ceux ci etant restreint aux noyaux, il me semble que les preARNm ne seront pas en assez grand nombre pour etre significatif. Sans compte qu'un preARNm n'est pas forcement poly adénylé, ce qui le rends difficilement séparable de l'ADNg or si tu as la moindre contamination par de l'ADN génomique ton experience est fichue, car tu ne regardes plus l'expression d'un gene. C'est d'ailleur une autre limitation , qui est que cette technique est difficilement utilisable pour des ARNm peu exprimes, car la probabilite d'arriver a les cloner est faible.

j'espere que ca t'aidera.
Yoyo

Je te remercie pour les informations que tu m'as fournies.
J'ai d'autres questions mais c'est plus sur la même chose. J'ai fait une transfection de cellules, je dois utiliser le surnageant de ces cellule spour transduire des Hela.
Le dit surnageant (10 mL) doit être ultra-centrifuger, je dois tester l'effet du surnageant frais, du surnageant centrifugé une fois (resuspendu dans 5 mL), centrifugé 2 fois (resuspendu dans 1mL) et centrifuger 2 fois + congeler à -20C.
Le hic c'est que je sais pas comment on fait pour calculer la concentration des virillons qui sont dans mes surnageants.

merci beaucoup,