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empreinte à la DNase I



  1. #1
    mikael69

    empreinte à la DNase I


    ------

    bonsoir à tous!
    dans un annal d'exam j'ai trouvé ca :

    Au cours du cycle du bactériophage Mu chez Escherichia coli, une série de
    promoteurs est activée de façon séquentielle. Le promoteur intermédiaire, Pm (Figure 1), est
    reconnu par l’ARN polymérase de l’hôte associée à s70 et il exige la présence d’une
    protéine du phage : Mor
    1) Dans une première expérience les auteurs réalisent une empreinte à la Dnase I
    (Figure 2). Un fragment de 198 pb a été utilisé avec des concentrations variables d’ARNpolymérase
    (RNAP) et de protéine Mor. Deux versions de l’ARN polymérase ont été
    utilisées : sauvage (WT) ou mutante, possédant une sous-unité a délétée du domaine Cterminal
    (DaCTD). L’expérience a été effectuée à 30°C (Figure 2 A et 2B) ou à 15°C (Figure
    2C).

    Et j'arrive à m'expliquer pas mal de choses sauf l'intérêt de faire une empreinte à la Dnase à 30° et une à 15° quel interet? sachant que la seule nuance que je vois sur les figures c'est un gros écart dans l'intensité des bandes et les memes sont manquantes lors de l'empreinte... la différence aurait été réalisée pendant la culture des bactérie j'aurai pu imaginer un influence de la température sur la conformation des protéines. mais là au niveau de la migration je ne vois que modérement l'interet...
    merci d'avance!

    -----

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  3. #2
    Yoyo

    Re : empreinte à la DNase I

    Salut

    tu pourrais pas nous montrer les figures?

    Sinon en général a 15 la DNase marche bcp moins bien qu'a 30°c si le complexe et faiblement attaché a l'ADN (donc ne le protege que aprtiellement) alors on aurait eut une différence, si ce n'est pas le cas, ca signifie que le complexe est fortement lié a la DNAse et protege efficacement l'ADN de la degradation

    Yoyo

  4. #3
    mikael69

    Re : empreinte à la DNase I

    oui bien sur voilà la figure 2. mais ca me parait logique, c'est un bon moyen je suppose de tester la spécificité de la fixation de MU. comme j'ai jamais ajouté de pièce jointe sur un forum j'espère que ca marche. Merci beaucoup!
    Images attachées Images attachées

  5. #4
    mikael69

    Re : empreinte à la DNase I

    et d'ailleurs c'est pas plutot le complexe qui est fortement lié à l'ADN et pas la DNase qui est selon moi juste l'enzyme qui assure la dégradation de l'ADN non protégé?

  6. #5
    Yoyo

    Re : empreinte à la DNase I

    Citation Envoyé par mikael69 Voir le message
    et d'ailleurs c'est pas plutot le complexe qui est fortement lié à l'ADN et pas la DNase qui est selon moi juste l'enzyme qui assure la dégradation de l'ADN non protégé?
    Si bien sur j'ai ecrit DNAse au lieu d'ADN l'activité spécifique de la DNAse depend de la temperature. Donc quand elle est tres active elle va avoir tendance a degrader l'ADN faiblement protégé, mais pas l'ADN fortement protégé. A 15°C l'enz est moins active donc elle ne degradera pas l'ADN meme faiblement protégé.

    yoyo

    EDIT: tu remarquera d'ailleurs que les deux exp n'ont pas ete faites tout a fait dans les meme conditions notamment en ce qui concerne (je suppose) les concentration de RNAP.
    Dernière modification par Yoyo ; 03/01/2007 à 11h14.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    mikael69

    Re : empreinte à la DNase I

    oui j'ai remarqué ca doit etre dû à mon avis à des difficultés soit de quantifier la quantité de RNAp soit de normaliser sa concentration (version mutée ou non, s'il avaient pu indiquer des concentrations précises ils l'auraient fait non?) soit au principe du "best results are shown" et que ca marchait mieux avec plus ou moins d'ARN pol.
    Dans tout les cas merci beaucoup!
    Comme quoi j'ai encore plein de choses à apprendre avant de devenir biotechnologiste! (si ca se dit)

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