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Problem:vecteur contenant GFP ne fluore pas



  1. #1
    rebreb

    Angry Problem:vecteur contenant GFP ne fluore pas

    Bonjour,
    j´ai crée un vecteur: promoteur 35S, suivi de l´ADN de ma proteine d´interet, suivi de GFP4. J´ai transformé mes petites Arabidopsis, ai sélectionné les transformées.. les ai observées avec microscope confocal........... et rien!!!aucun signe de fluorescence! je ne comprends pas!
    quelle peut bien etre l´explication?
    quelqu´un a déjà eu le meme probleme?
    se peut il que ma proteine ne puisse rien donné d´"exprimable" avec GFP!?!!
    merci d´avance

    -----


  2. #2
    Jean-Luc P

    Re : Problem:vecteur contenant GFP ne fluore pas

    Petites pistes à la volée :

    s'il s'agit d'un gène de fusion, le gène de la GFP est-il en phase ?
    Si il s'agit d'un gène GFP avec une promotion indépendante, ou une initiation alternative, cette initiation est-elle possible chez cet organisme et ya-t-il tous els éléments pour faire un ARNm fonctionnel (IRES ?) (Kozak ?) (polyA)

    Parfois les gènes de fusion font qu'une des deux protéines ne se replie pas correctement, dans ce cas on rajoute un espaceur. Mais en général c'est la GFP qui gagane à ce petit jeu.

    GFP4, c'est un variant de la GFP ? Une GFP tetramérique ?
    Jean-Luc
    La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
    Salvor Hardin

  3. #3
    doubleD

    Re : Problem:vecteur contenant GFP ne fluore pas

    salut
    est ce que t'as vérifié par une RT PCR que ton RNA s'exprimait?

  4. #4
    rebreb

    Re: Re : Problem:vecteur contenant GFP ne fluore pas

    Rebondissement: j´ai fait une extraction DNA, suivie d´une PCR pour déterminer si mes plantes -resistantes à BAsta, je tiens à le préciser!!- contenait 35Scassette/proteine/GFP... le vide complet! apparemment ma transformation n´a pas fonctionné. GFP n´est pas en cause!


    ce que je ne m´explique pas; comment puis-je avoir des Arabidopsis resistantes si elles n´ont pas été transformées!!!!!?????

    GFP4 est un GFP "spécial plante" dont les acides aminés ont été légèrement modifiés pour garder la forme de GFP, mais ont la particcularité d´etre mieux lus par la machinerie végétale.. qui préfère certains triplets d´aa à d´autres -plus "animal"
    j´espère que ma définition est compréhensible..

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