Méthode ELISPOT !

[invite4b762021]

Bonjour a tous ,,, comme je suis toujours bloqué avec mon projet ,,, voir sujet MUC1 ,,, pouvez vous m'expliquer les principes de la méthode ELISPOT ! et comment peut on analyser les résultats de cette méthode ??
-----

[invite9eab997a]

Salut,

avec un elispot, tu peux compter le nombre de cellules qui sécrètent un facteur donné (IFNg par exemple). En gros, tu actives tes cellules puis tu les déposes dans un puit coaté avec des anticorps dirigés contre l'IFNg. Ensuite tu révèles l'IFNg par une méthode Elisa utilisant un substrat insoluble qui va précipiter et te donner des taches colorées ou immunospots. Un spot=une cellule sécrétrice.
Ensuite, ya plus qu'à compter (avec un lecteur de préférence ).

[invite4b762021]

y'a un truc qui cloche dans ma tête ,,,,, moi je voudrais voir le taux d'adhesion cellulaire par rapport au taux d'une glycoprot (muc1) trouvé dans les cellules ,,, comme on connait pas de ligand spécifique de muc1 ,, et moi je voudrais voir comment les cellules interagit entre elle selon le taux de cette glycoprot ! la question ,,, si j'arrive a mettre dans ma boite Elispot ,, plusieurs type de recepteurs ou de molécules d'adhesions trouvé sur toutes les cellules ,, quand je ferais pousser mes cellules dessus ! y'en à qui vont se fixer ,, avec l'intermédiaire de molécules d'adhesion differentes ,,, ces molecules qui se fixent peut etre muc1 ,, mais pas nécesairement ,,, >> Quand je fait le lavage de cellules ,,,,, les cellules qui sont attaché au ligands sont relargé est les liaisons sont cassé ,, et en faite ce qui reste sur ma boite serais des ligands avec les protéines secréte par ces cellules ,,, dans ce cas ,, je pourais voir si muc1 était impliqué ou pas ,, en utlisant des Anticorps ,,,,

Donc questions ,,,, le lavage ,,, est-ce quil casse les liaisons entre les cellules et les ligands ,,, ou au final y'auras un nombre de cellules collé dans ma boite ???

[invite9eab997a]

Salut,
je ne sais pas trop si ta technique peut marcher. Ca depend de la force des interactions et rien ne garantit que le fond de ton puits sera parfaitement recouvert et qu'il n'y aura pas un petit coin de plastique où adhérer.
Si tu possèdes de la muc1 purifiée, je te conseillerais plutot de tenter une purif du ligand par chromato. Ou une IP si tu as un anticorps anti muc1.
Bon courage.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4b762021]

oui ,, mais une IP ,,, ne me permettrai pas de voir le rôle de muc1 dans l'adhesion cellulaire ! ca me servirais seulement comme controle pour prouver que mes inhibieteur par exemple ont bien fonctionner ! sinon ,, determiner le ligand par chromatographie ! je vois pas comment ,,, sachant qu'on connait pas précisement si il y'aurai un ligand muc1 !
dans tout les cas merci ! je suis reconnaissant cde m'avoir répondus

[invite9eab997a]

Salut,
pour la chromato, je pensais à fixer muc1 sur des billes de sépharose et incuber avec du lysat cellulaire. Ensuite, tu passes l'éluat sur western. Tu peux colorer la membrane au rouge ponceau pour avoir une idée de la taille des protéines récupérées puis, en fonction des différentes possbilités, tester les anticorps.
L'IP peut servir au meme but.
Une fois que tu as le couple ligand/récepteur, c'est plus facile d'avoir des tests fonctionnels.

[invite4b762021]

Merci pour l'aide BioCell ,,, je voiais pas les choses comme ça ,,, sinon ,, je sais pas si j'aurais assez de temps pour faire toutes les manipulations que j'ai en tete ! Mais grand merci !