L'expérience mystère..

[invite5351d78c]

Salut,

J'ai eu l'idée de lancer ce fil "l'expérience mystère" car toute personne en laboratoire est souvent confronté à une problématique avec certaines informations de départ. Pour résoudre cette problématique, il faut passer par des expériences, des techniques et mettre au point une stratégie. Souvent la qualité du résultat final dépend en grande partie des outils que l'on a choisit d'utiliser et de la stratégie expérimentale développée.

Donc ici, sous forme ludique, je propose qu'on lance une problématique (détermination de la fonction d'une protéine, d'un mécanisme fondamental, trouver les gènes associés à un phénotype,...) avec certaines informations de départ minimales, un contexte (génome séquencé ou pas, fragment d'ADN inconnu, partenaires protéiques déjà caractérisés,...). Il peut être très intéressant de se servir de la problématique d'une publication et par la suite comparer nos stratégies à la leur.

Il faudra donc proposer les techniques globales qu'on peut utiliser, et développer une stratégie optimale. Bien sûr plusieurs stratégies et techniques sont possibles car le domaine expérimental n'est pas figé. Le mieux est donc de fournir les idées générales puis de développer.

Je commence : Grâce à un Southern, on a pu isoler un fragment d'ADN de 50 Kilobases issu d'une banque génomique d'une espèce très rare de papillon d'Amazonie. Ce fragment coderait un gène capital pour la survie de cette espèce, mais ceci reste à confirmer. Etant très rare, son génome n'a pas été séquencé.
Quelles techniques peut-on utiliser pour tirer un maximum d'informations sur ce fragment et y apposer un maximum d'annotations?

J'attends vos propositions

Let's go!!!
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[inviteb8e8d8c3]

Tu peux faire un Blast sur NCBI, ça peut peut-être trouver des analogies avec d'autres espèces ou trouver des régions spécifiques à certaines fonctions. Bien sûr, il faut connaître la séquence de ton gène avant. A première vue, ce serait la méthode la plus simple et la plus rapide pour obtenir quelquechose.

[invite5351d78c]

Pour ce qui est du séquençage, je suis d'accord, c'est le premier truc à faire. Par contre, le Blast est trop imprécis pour mettre des annotations sur la séquence. On pourra s'en servir mais plus tard, avant ya un gros paquet de truc...

Donc en effet le séquençage du fragment est le premier truc à faire. Maintenant qu'on a la séquence, qu'est-ce qu'on peut envisager de faire?

[Vinc]

Salut!

Pour ce qui est du séquençage, je suis d'accord, c'est le premier truc à faire. Par contre, le Blast est trop imprécis pour mettre des annotations sur la séquence. On pourra s'en servir mais plus tard, avant ya un gros paquet de truc...

Non je ne suis pas d'accord (et tu as du culot parce qu'on en a déjà parlé ) et c'est la procédure classique lorsque l'ona une séquence inconnue : on la compare à ce que l'on connait, ça n'engage à rien!
Faire un BLAST ne va rien te couter, ça va te prendre 1 minute grand maximum et ça peut rapporter gros! Alors oui il est clair qu'il faut se méfier des annotations des banques mais si tu tombes sur une protéine bien connue il y a de forte chance pour que l'annotation soit correcte.
Si tu as des doutes tu peux très facilement vérifier si c'est ta protéine ou pas, en la produisant à partir du cDNA et en faisant un simple dot blot par exemple..... Donc même si il faut se méfier de la fiabilité des BLAST, ça ne coûte quasiement rien en terme de temps et de matériel mais ça peut faire gagner un temps fou!
Donc il ne fat pas utiliser le BLAST à outrance pour faire tout et n'importe quoi, être bien conscient de ses limites mais ce n'est pas pour ça qu'il faut jetter cette analyse qui a rendu de très grands services!
Et en plus tu vas méchamment galérer pour déterminer la fonction d'une protéine inconnue : l'ensemble des études fonctionelles va te prendre quelques années....

Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5351d78c]

Qui a dit que l'on voulait avoir des informations sur la protéine codée? On veut avoir des annotations et les plus précises possibles. Le Blast ne peut pas nous donner des annotations à la base près, c'est totalement impossible dans ce cas.

Et j'ai jamais dit que je voulais en arriver jusqu'à la protéine, ni faire une course contre la montre pour savoir si c'est une protéine connue, sa fonction. Mon papillon n'est pas un papilllon tueur sur lequel il faut trouver son point faible au péril de l'humanité. Les annotations à mettre son du même type que celles qui sont mises sur le génome humain et ça m'étonnerait que ces annotations ait été faites avec du Blast. Le blast n'étant là que pour lancer une piste ou se faire une idée. Mais à un moment donné le concret doit arriver par l'expérimental.

Donc le Blast peut se faire mais si on découvre certaines annotations qui pourraient se rapprocher de la réalité, il faut confirmer par une technique. Donc que peut-on chercher sur la séquence du fragment, quelles annotations peut-on mettre, et quelles techniques utiliser pour déterminer leur nombre (si elles peuvent être plusieurs) et leur position?

[Vinc]

Salut!

Qui a dit que l'on voulait avoir des informations sur la protéine codée?

Bon alors là soit c'est de l'humour, soit c'est de la mauvaise foi...... Faut arrêter : si tu recherches le maximum d'informations sur un gène sans te préoccuper de la protéine pour laquelle il code c'est qu'il y a manifestement un problème.... Ca va te servir à quoi d'avoir ta séquence annotée si tu ne sais pas à quoi elle sert???
Tu joues sur les mots là pour moi....

On veut avoir des annotations et les plus précises possibles. Le Blast ne peut pas nous donner des annotations à la base près, c'est totalement impossible dans ce cas.

Mais qu'est ce que tu me racontes???
Le BLAST va te dire si ta séquence est homologue a une séquence déjà connue! Il n'a pas pour but d'annoter une séquence inconnue!!!! Le but ici c'est de savoir si notre gène est connu et si des infos sont déjà répertoriées, avant de se lancer dans des études fonctionnelles très longues et de perdre un temps fou!!
Je vais te donner un exemple! Imagine que tu tombes sur une séquence, tu la BLAST et là tu t'aperçois que le gène question code pour un truc super connu comme par exemple p53!!!! Ne me dis pas que ça ne vaut pas le coup de blaster, parce que là si tu n'avais pas vu que c'était p53 tu étais partis pour 10 ans (sauf si tu es malin et que tu t'en aperçois avant la fin de l'étude fonctionnelle).

Et j'ai jamais dit que je voulais en arriver jusqu'à la protéine, ni faire une course contre la montre pour savoir si c'est une protéine connue, sa fonction.

J'espère que tu plaisantes.....
D'accord donc toi ton plaisir c'est de passer des années à étudier un gène, peut-être déjà connu, sans te soucier un seul instant de son rôle fonctionnel????? Attend là faut pas pousser!!!

Mon papillon n'est pas un papilllon tueur sur lequel il faut trouver son point faible au péril de l'humanité.

Ca aussi c'est de la mauvaise foi! Tu te réfugies derrière un détail de l'énoncé dont on se fout complètement!

Les annotations à mettre son du même type que celles qui sont mises sur le génome humain et ça m'étonnerait que ces annotations ait été faites avec du Blast. Le blast n'étant là que pour lancer une piste ou se faire une idée. Mais à un moment donné le concret doit arriver par l'expérimental.

Ben si justement! Quand tu as une séquence inconnue, la première chose à faire est de la blaster dans les banques!!! Ce que je ne comprends pas c'est pourquoi tu ne veux pas le faire alors que ca prend 5 minutes et que ça n'engage à rien! Tu crois franchement que c'est mieux d'avancer à l'aveuglette sans savoir ce que tu cherches??? Je n'ai jamais dit que le BLAST se suffisait à lui même mais ça reste un outil puissant qu'il faut utiliser quoi que tu veuilles faire derrière....

Donc le Blast peut se faire mais si on découvre certaines annotations qui pourraient se rapprocher de la réalité, il faut confirmer par une technique.

Non mais attend je n'ai jamais dit le contraire! Je te répète depuis le début que l'on commence par ça pour se mettre éventuellement sur une voie alors que toi tu nous sorts:

Par contre, le Blast est trop imprécis pour mettre des annotations sur la séquence. On pourra s'en servir mais plus tard, avant ya un gros paquet de truc...

Plus tard????? Quand tu auras fais toutes les études fonctionnelles au bout de 10 ans???

C'est le serpent qui se mort la queue.......

A+
Vinc

[invite5351d78c]

Salut,

mais depuis le départ je n'ai jamais rejetté totalement le Blast. Mais ce n'est là que pour se faire une idée. Et par rapport à tout ce qu'il est possible de faire avant de faire des études fonctionnelles où là évidemment, le Blast est de rigueur, je me dis que le blast n'est que là pour se faire une idée, pour ce qui concerne le début de la stratégie.

Vu que personne répond quand même, je dis quel était le premier gros point auquel je pensais. Vu que c'est des annotations de séquence génomique, je pensais tout simplement à toutes les techniques permettant de déterminer la structure d'un gène, et pour ça ya une grosse partie qui peut se faire sans passer par l'expression de la protéine codé par le gène.

Donc, maintenant que ce point là est clarifié (j'ai l'impression de m'amuser tout seul là ):
Quelles méthodes peut-on utiliser pour déterminer la structure du gène?

PS : Dans le cas de cette détermination structurale d'un gène, le Blast peut en effet nous permettre de savoir si notre fragment contient le gène entier ou s'il manque des régions en 5' et 3' du fragment. Je reconnais...

A+